大豆分離蛋白基脂肪模擬物初步研究

成媛媛，王建輝，劉永樂，王發祥，李向紅，俞 健，張開勤

長沙理工大學化學與生物工程學院，長沙 410114

脂肪具有宜人的口感，是許多風味物質的載體，深受消費者喜愛，但過量攝入，會帶來肥胖癥、高血壓、心臟病、動脈硬化、糖尿病、膽結石等健康問題。因此，在滿足人們對風味追求的同時減少疾病的發生，以碳水化合物、蛋白質或脂肪等為基料，混合乳化劑、增稠劑等制成，能被人體消化吸收但提供較低能量或不能被人體消化而對人體不提供能量的脂肪模擬物應運而生［1］。其中，蛋白質基脂肪模擬物占很大一部分［2］。因蛋白質變性后，分子中的疏水基團和區域暴露于分子表面，能模擬油脂的疏水性狀，同時微粒化蛋白質水合后，分散液中水合蛋白質顆粒直徑可以小于10 μm，此時，舌頭不能分辨出單個顆粒，制品不再具有粗糙的顆粒感，因而能模擬出脂肪良好的潤滑、奶油狀感官特征［3］。

大豆分離蛋白［4］(soy protein isolate，SPI)是以大豆為原料生產而成的優質蛋白質，其蛋白含量超過90%，消化利用率高達93%～97%，并且其起泡性、溶解性、乳化性、粘彈性、凝膠性和吸水吸油性等性能優良。大豆分離蛋白及其水解液能降低肝臟脂肪合成酶的活性，降低血漿中葡萄糖水平，加快脂肪與能量新陳代謝。因此，其產品可作為治療肥胖癥中限制飲食能量的最合適的蛋白質來源［5］。用大豆分離蛋白作為脂肪模擬物不僅能提供優質蛋白質來源，還能減少脂肪中能量的攝入，從而降低因脂肪的過量攝入而引起的肥胖、高血壓、高血脂等富貴病。目前大豆分離蛋白改性方法有物理法、化學法、酶法和基因工程法等，本文主要采用物理改性法，對大豆分離蛋白實施濕熱處理形成松散柔軟的疏水性蛋白質顆粒，再經高速剪切處理，從而研制出能模擬天然油脂潤滑、細膩口感特性，獲得與市售植物油相似的流變特性，且具有較好乳化穩定性的大豆分離蛋白基脂肪模擬物。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白，自制(堿提酸沉法，其蛋白含量達90%以上);長康均衡調和油，市購;十二烷基硫酸鈉(SDS)(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器與設備

AR1500ex 流變儀(美國TA 公司);T10 均質機(德國IKA 公司);AUY120 島津電子分析天平(日本島津公司);DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司);78-1 磁力加熱攪拌器(金壇市醫療儀器廠);DS-1 高速組織搗碎機(上海標本模型廠制造);UV2600 型紫外可見分光光度計(上海舜寧恒平科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 粘度的測定

采用AR1500ex 流變儀，直徑為40 mm 平行板夾具，間距1000 μm，測量溫度25 ℃，穩態模式，剪切速率范圍:0.1～100 s-1，測定粘度及剪切應力隨剪切速率的變化。

1.3.2 乳化性的測定

取50 mL 改性后的大豆分離蛋白溶液于高速組織搗碎機，加入同體積植物油，以20000 r/min 均質2 min，從乳濁液底部以t 時間間隔(t 分別為0、30 min)取100 μL 乳濁液，迅速與10 mL 0.1%的SDS溶液混合，于500 nm 波長下測定t 時刻的吸光度。乳化穩定性用ESI表示:

1.3.3 改性條件的單因素實驗

1.3.3.1 蛋白質濃度

固定加熱溫度90 ℃、加熱時間20 min、均質時間30 s，考察不同蛋白質濃度(6%、7%、8%、9%、10%，g/mL)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩定性的影響。

1.3.3.2 加熱溫度

固定蛋白質濃度9%、加熱時間20 min、均質時間30 s，考察不同加熱溫度(50、60、70、80、90 ℃)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩定性的影響。

1.3.3.3 加熱時間

固定蛋白質濃度9%、加熱溫度80 ℃、均質時間30 s，考察不同加熱時間(10、20、30、40、50 min)對大豆分離蛋白溶液流變性能及乳化穩定性的影響。

1.3.3.4 均質時間

固定蛋白質濃度9%、加熱溫度80 ℃、加熱時間10 min，考察不同均質時間(10、20、30、40、50 s)對大豆分離蛋白溶液流變性能與乳化穩定性的影響。

1.3.4 二因素正交中心組合實驗設計

根據單因素實驗結果，選取加熱溫度與蛋白濃度兩個因素進行響應面實驗設計［7］，旨以得到與植物油相似流變性能(取剪切速率為100 s-1下的粘度進行比較)及具有良好乳化穩定性的大豆分離蛋白樣品。具體因素水平見表1。

表1 二因素正交中心組合實驗設計表Table 1 Two factors orthogonal center composition design

2 結果與討論

2.1 調和油流變性

由圖1 可知，當剪切速率大于10 s-1時，調和油粘度隨剪切速率的增加變化不大，表現為牛頓流體的特性;當剪切速率在0～10 s-1范圍內時，調和油粘度隨剪切速率的增加顯著下降，可能緣于在微小剪切力擾動作用增加的過程中，分子間的相互作用逐漸遭破壞，粘度有所下降。本研究主要為模擬調和油流變性能，以獲得與調和油流變性能相近且乳化穩定性良好的變性大豆分離蛋白，進行中心組合試驗時選取剪切速率為100 s-1條件下調和油粘度46.3 mPa·s 作為參照值。

圖1 調和油粘度與剪切速率曲線Fig.1 Viscosity and shear rate curve of blend oil

2.2 蛋白質濃度對大豆分離蛋白改性的影響

蛋白質的粘度是指液體流動時表現出的內摩擦，而感官評定中的滑膩感主要與其粘度呈明顯正相關。大豆分離蛋白經熱處理后，溶液的表觀粘度隨蛋白質濃度增加而升高。乳化穩定性是蛋白質的一種重要功能性質，表征了大豆分離蛋白維持兩相穩定存在的能力［8］。如圖2 所示，各蛋白溶液的粘度均隨剪切速率的增加而減小，表現為假塑性流體。在同一剪切速率下，隨蛋白質濃度的增加粘度增大，由于蛋白質濃度增加，蛋白質分子間的作用增強，分子間結構發生變化，從而使大豆分離蛋白溶液的粘度增大［9］，當蛋白質濃度為9%時，其粘度與調和油粘度最為接近，且其流體行為越接近于理想狀態的牛頓流體。由圖3 知，當蛋白質濃度低于9%時，乳化穩定性隨蛋白質濃度的增加而增加，當蛋白質濃度高于9%時，其乳化穩定性的變化趨于平緩。這是緣于低濃度下表面張力隨蛋白質濃度增加而迅速減小，當濃度上升到一定程度時，每50～200 個蛋白質分子聚集成團形成膠束，從而乳化性提高，但當乳液達到臨界膠束濃度后，油水界面上的蛋白質不隨濃度增加而增多，導致乳化穩定性不再升高［10］。因此，此條件下選擇最佳濃度蛋白質濃度為9%。

圖2 不同蛋白質濃度下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.2 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified under different concentrations

圖3 蛋白質濃度對改性蛋白溶液乳化穩定性的影響Fig.3 Effect of protein concentration on emulsion stability of soy protein modification

2.3 加熱溫度對大豆分離蛋白改性的影響

蛋白質的熱處理會造成蛋白質結構變化、肽鍵水解、氨基酸側鏈的改性以及蛋白質分子與其他分子間的縮合，大豆分離蛋白的乳化作用取決于可溶性氮的溶解指數。隨溫度的升高，蛋白質分子的熱運動增強，內部結構被破壞，分子間的粘滯作用減弱，蛋白質溶液的粘度降低。而大豆分離蛋白的變性溫度一般在50 ℃，隨溫度的升高，其氮溶解指數降低，變性之后，隨溫度升高，蛋白質主鏈上的疏水性基團展開，疏水氨基酸暴露，使大豆分離蛋白溶液在油水界面中具有很好的定位［9］。由圖4 可知，在不同溫度下，蛋白質溶液的粘度均隨剪切速率的增加而減小，表現為假塑性流體。同一剪切速率下，其粘度隨加熱溫度的增加而減小，當加熱溫度為80 ℃時，蛋白質溶液粘度與調和油粘度最為接近，且其流體行為越接近于理想狀態的牛頓流體。由圖5 知，大豆分離蛋白溶液的乳化穩定性隨加熱溫度的升高而增強，當加熱溫度為80 ℃時大豆分離蛋白溶液的乳化穩定性基本趨于穩定，綜合考慮選取80 ℃為最佳改性溫度。

圖4 不同加熱溫度下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.4 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different heating temperature

圖5 加熱溫度對改性蛋白溶液乳化穩定性的影響Fig.5 Effect of heating temperature on emulsion stability of soy protein modification

2.4 加熱時間對大豆分離蛋白改性的影響

熱處理有利于促進蛋白質分子表面暴露的疏水性氨基酸殘基的增加，并伴隨著油膜厚度的增加，蛋白質的乳化穩定性增強。但過度的熱處理，大豆分離蛋白7S 各亞基及部分11S 酸性亞基和堿性亞基發生聚合，形成分子量更高的聚合物。由于空氣的粘度低，與蛋白質疏水基團的相互作用較弱，高分子量的蛋白質聚合物擴散到氣/水界面及在界面的吸附能力也較低，從而降低了蛋白質的粘度與乳化穩定性［6］。由圖6 可知，蛋白質溶液流變特性均為剪切變稀，表現為假塑性流體。隨著加熱時間延長其粘度總體呈現下降趨勢，當加熱時間為10 min，隨剪切速率的增大其剪切稀化行為趨于平緩，接近于理想狀態的牛頓流體，與調和油流變行為最為接近。由圖7 知，當加熱時間低于20 min 時，大豆分離蛋白溶液乳化穩定性均變化不大，當加熱時間高于20 min 時，其乳化穩定性逐漸下降。因此，綜合選取加熱時間為10 min。

圖6 不同加熱時間下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.6 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different heating time

圖7 加熱時間對改性蛋白溶液乳化穩定性的影響Fig.7 Effect of heating time on emulsion stability of soy protein modification

2.5 均質時間對大豆分離蛋白改性的影響

大豆分離蛋白在變性條件下因變性而展開，發生粘附，凝聚形成較大的顆粒，從而不能模擬脂肪的感官特性，因此在大豆分離蛋白變性、凝聚過程中進行高速剪切處理，即可防止較大凝聚顆粒的形成，使顆粒大小保持在0.1～2.0 μm，處于舌頭感官閾值之下，此時舌頭分辨不出，可模擬脂肪良好的潤滑、奶油狀感官特性［11］。由圖8 可知，蛋白質溶液均為剪切變稀，表現為假塑性流體。隨著均質時間的延長其稀化行為減弱，當剪切速率增加到100 s-1時，不同均質時間下的蛋白溶液粘度均較接近調和油粘度，且40 s 條件下最為接近。由圖9 知，均質時間對大豆分離蛋白溶液乳化穩定性的影響不大，當均質時間為40 s 時乳化穩定性達最大，綜合考慮，選取40 s 為最佳均質時間。

圖8 不同均質時間下改性蛋白溶液粘度與剪切速率曲線Fig.8 Viscosity and shear rate curve of soy protein modified with different homogeneity time

圖9 均質時間對改性蛋白溶液乳化穩定性的影響Fig.9 Effect of homogeneity time on emulsion stability of soy protein modification

2.6 加熱溫度和蛋白質濃度對大豆分離蛋白改性的影響

在確定加熱時間10 min，均質時間40 s 的條件下，以蛋白質濃度和加熱溫度為影響因子，以大豆分離蛋白溶液粘度(剪切速率為100 s-1下)和乳化穩定性為響應值，通過響應面實驗研究物理改性對大豆分離蛋白粘度與乳化穩定性的影響。利用Design-expert 軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，實驗結果及擬合方程分別見表2、3。

由表3 可知，得到的兩個數學擬合模型的R2值分別為0.93 和0.96，可見通過多元二次回歸得到的Y1和Y2的模型與試驗擬合很好，具有較高的可靠性。當P 值小于0.01 時，即表示該項指標極顯著。根據Y1和Y2的模型的方差分析結果，推測出大豆分離蛋白粘度及乳化穩定性建立的回歸整體數學模型均為極顯著(P ＜0.01)。

對于大豆分離蛋白溶液粘度(Y1)模型，擬合數學模型的方差分析結果表明模型中兩個因素的平方項影響為極顯著(P ＜0.01)(表4)。同時，由兩個因素的F 值大小可推斷，在所選擇的試驗條件下，兩個因素對大豆分離蛋白溶液粘度的影響的排序為:蛋白質濃度＞加熱溫度。對于大豆分離蛋白溶液乳化穩定性(Y2)模型，擬合數學模型的方差分析結果表明模型中兩個因素的線性和平方項的影響為極顯著(P ＜0.01)(表4)。根據兩個因素的F 值大小可推斷，在所選擇的試驗條件下，兩個因素對大豆分離蛋白溶液乳化穩定性的影響的排序為:蛋白質濃度＞加熱溫度。

根據回歸方程作出等高線圖及響應曲面圖(圖10，圖11)，由等高線圖可以看出在蛋白質濃度較大而溫度適中時，大豆分離蛋白的粘度與調和油接近，且乳化穩定性較高。應用Design-expert 軟件優化程序，得到最佳大豆分離蛋白改性工藝參數:蛋白質濃度9.08%、加熱溫度79.59 ℃，此條件下大豆分離蛋白粘度為46.3 mPa·s，乳化穩定性為50.13 min。

考慮實際操作的可行性，將大豆分離蛋白物理改性的工藝條件修正為蛋白質濃度9.10%、加熱溫度79.6 ℃，在此優化條件下進行驗證實驗3 次，測得大豆分離蛋白溶液的粘度為46.8 mPa·s，理論預測值為46.3 mPa·s;乳化穩定性為49.15 min，理論預測值為50.13 min。預測值與實測值非常接近，偏差較小，說明試驗設計和數學模型具有可靠性與重現性。

表2 正交中心組合實驗設計表及實驗結果Table 2 Result of two factor orthogonal center composition design experiments

表3 模型擬合結果Table 3 Outcomes of model fitting

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

注:* 影響顯著，P ＜0.05;＊＊影響極顯著，P ＜0.01。Note:* significant(P ＜0.05)，＊＊ very significant(P ＜0.01).

圖10 蛋白質濃度和加熱溫度對大豆分離蛋白溶液粘度的影響Fig.10 Effect of protein concentrations and heating temperature on viscosity of SPI

圖11 蛋白質濃度和加熱溫度對大豆分離蛋白溶液乳化穩定性的影響Fig.11 Effect of protein concentrations and heating temperature on emulsion stability of SPI

3 結論

隨著現代生活中因高脂肪攝入所導致的肥胖等富貴病的涌現，脂肪模擬物已倍受人們關注，并成為一股不可逆轉的潮流［12］。本文是以市售植物油為參考，以大豆分離蛋白為原料通過物理改性法模擬油脂，以期達到與市售植物油相似的流變特性，并具有良好的乳化穩定性。在單因素試驗基礎上，運用響應面法對大豆分離蛋白改性工藝進行優化，大豆分離蛋白基脂肪模擬物的最佳工藝條件為蛋白質濃度9.10%、加熱溫度79.6 ℃、加熱時間10 min、均質時間40 s，此時，溶液粘度達到46.8 mPa·s，乳化穩定性為49.15 min，其粘度與乳化穩定性與市售調和油相似，可模擬出脂肪良好的潤滑、奶油狀口感。大豆分離蛋白濕熱變性暴露出多肽鏈上的疏水基團，產生親油性而提高蛋白質的乳化特性，進而改善低脂食品的質構［13］，從而能作為蛋白質基模擬脂肪。脂肪模擬物已被消費者所接受，其市場前景廣闊，但目前尚無可完全取代脂肪功能特性與感官特性的理想的單一脂肪模擬物，而本研究以單一的大豆分離蛋白為研究對象，通過粘度和乳化性能的擬合，得到了最佳擬合參數，然以期達到更好的模擬效果，仍需開展進一步的研究。

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