水解乳蛋白的制備及在細胞培養中的初步應用

田 偉 ，馮玉萍，李明生，崔夢楠，靳冬武，龍仕和，馬忠仁*

1西北民族大學生命科學與工程學院;2 甘肅省動物細胞工程技術研究中心，蘭州 730030

水解乳蛋白是乳蛋白經蛋白酶或肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸和多肽，可為細胞生長提供多種營養成分、貼壁因子及生長因子類似物等［1］，廣泛用于生物制藥、疫苗、食品等行業。Eagle 等［2，3］20 世紀50 年代將水解乳蛋白用于細胞和微生物培養基，隨后Mamoru［4］，Amiot［5］等分別將水解乳蛋白用于皮膚、器官等多種細胞的培養。我國學者張爾賢［6］于1986 年從原料、酶制劑及產品檢測等多個角度探討了細胞培養用水解乳蛋白的研制過程，這為國內水解乳蛋白的研制奠定了基礎。

目前國內水解乳蛋白主要以美國Hyclone 和Gibco 產品為主，開發水解乳蛋白在國內具有廣闊的市場前景。試驗針對傳統工藝水解率低，氨基酸破壞程度高，污染環境等缺陷，選取天然牧區凝乳酶干酪素為原料，用復合蛋白酶水解酪蛋白，以多肽含量和氨基氮含量為指標優化酶解工藝，對所得粗制品進行游離氨基酸等一系列檢測。最后選取兩種常用的動物細胞進行培養，研究其對動物細胞生長的影響，以期為細胞培養用水解乳蛋白的大規模生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

凝乳酶干酪素為甘肅省動物細胞工程技術研究中心自制;胰酶由西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室提供(胰蛋白酶1298 U/g;胰淀粉酶17503 U/g;胰脂肪酶7200 U/g);中性蛋白酶購自南寧龐博(20 萬U/g);谷胱甘肽標準品購自索萊寶公司。

1.2 儀器與設備

L-8900 氨基酸分析儀(日本日立);SD-1500 噴霧干燥機(上海沃迪科技);BioMate5 紫外分光光度計(美國Thermo Fisher);SG-2 pH 計(美國METTLER TOLEDO);HJ-6A 加熱攪拌器(常州國華);LC-6M 離心機(上海離心機械研究所);CKX41 顯微鏡(OLYMPUS)。

1.3 方法

1.3.1 最佳工藝條件的確定

根據復合酶的最佳使用條件并結合單因素試驗結果確定各因素適合的酶解范圍，設計L9(34)正交試驗，方案見表1。

表1 正交試驗方案Table 1 Orthogonal experiment design

1.3.2 水解乳蛋白的制備

配制5%［5］的酪蛋白水溶液，pH 調至8.0，加熱至完全溶解，迅速冷卻，按L9(34)正交試驗篩選得最優組合控制酶解條件，反應結束后將反應體系置于沸水浴中維持10 min，迅速冷卻，離心取上清噴霧干燥。

噴干條件:進風溫度180 ℃，出風溫度90 ℃，風速45 Hz，流速200 mL。

1.3.3 蛋白水解液中氨基氮含量測定

氨基氮含量的測定參考甲醛滴定法［7］。

1.3.4 蛋白水解液多肽含量測定

采用肽鍵測定法［8］。所得回歸方程:Y=0.095X+0.004，R2=1.0000。

1.3.5 游離氨基酸測定

樣品前處理［9］:準確移取水解蛋白液于試管中，加入等體積5% 的三氯乙酸，充分震蕩搖勻，3800 rpm 離心5 min，除去蛋白，取上清液用0.45 μm 微孔濾膜過濾后上機。

色譜條件:泵1(洗脫溶液)流速:0.100 mL/min;泵2(茚三酮溶液)流速:0.100 mL/min;分析柱溫度:50 ℃;反應柱溫度:135 ℃;進樣體積:20 μL。

1.3.6 細胞培養試驗

配制水解乳蛋白終濃度為0.2%含10%胎牛血清的MEM 培養基，用對應濃度的Hyclone 產品作為對照，以1.0 ×104/mL 的細胞濃度接種BHK 和Vero 細胞于96 孔板培養。每隔24 h 觀察細胞生長情況，并計數。

2 結果與分析

2.1 最佳工藝條件的確定

2.1.1 水解時間的確定

試驗數據顯示不同條件下水解時間對氨基氮含量的影響呈現一定規律性，結果見圖1。

圖1 水解時間對氨基氮的影響Fig.1 The influence of hydrolysis time on amino nitrogen content

水解乳蛋白需具有滿足細胞生長所需要的多種氨基酸［6］，而氨基氮含量與游離氨基酸含量成正比。從圖1 可看出，不同反應條件下，產物中氨基氮含量在反應初期緩慢上升，至6 h 最大，隨后緩慢降低至平穩。這是由于反應初期酪蛋白解聚不徹底，與酶結合較少;一段時間后底物徹底解聚，底物上反應位點逐漸被酶分子飽和。因此，水解乳蛋白制備的水解時間為6 h。

2.1.2 工藝條件的優化

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.1.2.1 以氨基氮含量為指標的正交試驗結果分析

表2 中以氨基氮含量為指標的極差分析顯示，各因素影響氨基氮含量的主次順序為:酶量＞酶組分＞溫度＞pH，最優組合為A1B1C1D1。

2.1.2.2 以多肽含量為指標的正交試驗結果分析

由表2 以多肽含量為指標的極差分析顯示，各因素對多肽含量影響的主次順序為:酶量＞pH ＞溫度＞酶組分，最優組合為A1B1C1D1。

綜上所述，各因素對兩個指標影響的主次順序略有差異，但對兩者影響的最優組合是一致的。因此，復合蛋白酶(胰酶:中性蛋白酶=2∶1)水解酪蛋白制備水解乳蛋白的最優工藝條件為:40 ℃，pH=7.0，E/S=1∶5 水解6 h。

2.2 對自制水解乳蛋白的檢測

按正交試驗篩選的最優條件進行不同規模放大驗證試驗，對產物進行分析，結果如下:

2.2.1 氨基氮及多肽含量測定

表3 不同批次放大驗證試驗Table 3 Different batches validation test

結果表明，在最優條件下，不同規模放大各指標基本穩定，收率(以酪蛋白算)為40.20%，氨基氮含量平均為3.21 g/L，多肽含量平均為35.63 g/L。

2.2.2 氨基酸組分測定

配制5%的自制水解乳蛋白，以5%的Hyclone水解乳蛋白作對照，測定常用18 種游離氨基酸組分，圖譜見圖2。

圖2 Hyclone 對照品(A)和樣品(B)的氨基酸色譜圖Fig.2 Chromatograms of Hyclone standard (A)and sample (B)

在細胞培養過程中使用水解乳蛋白目的是滿足細胞生長所需要的多種氨基酸，不僅種類上有要求，而且需要保證各種氨基酸的數量［10］。由圖2 看出，自制樣品分離效果較好，與Hyclone 產品基本一致。自制品和對照品均有17 種常用游離氨基酸，各氨基酸含量有一定的差異，結果見表4。

表4 產物氨基酸組成Table 4 Amino acids composition of the lacto-protein hydrolysate

由表4 可看出，自制水解乳蛋白中賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸含量高，這與胰酶中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的專一性有關。其中酸性氨基酸(如谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)含量較高，這與酪蛋白有明顯酸性是一致的。酪蛋白中超過55%的氨基酸有極性基團，而水解產物中極性氨基酸含量均較高。另外，自制水解乳蛋白氨基酸總量也明顯高于對照品，而個別氨基酸卻遠遠低于對照品。這與兩者所用原料不同有關。

2.3 水解乳蛋白對細胞生長的影響

通過細胞計數和細胞形態圖反應水解乳蛋白對細胞生長的影響，結果如下:

2.3.1 細胞計數

由表5(細胞計數結果)可看出，細胞培養24 h時，BHK 和Vero 細胞的密度分別為4.0 ×104/mL和6.0 ×104/mL，兩者均為各自空白的2.0 倍;與Hyclone 產品相比，BHK 和Vero 細胞的密度分別是Hyclone 的1.0 倍和0.86 倍。48 h 時，BHK 和Vero細胞的密度分別為1.5 ×105/mL 和1.6 ×105/mL，是各自空白的5.0 倍和4.0 倍，與Hyclone 產品相比，兩細胞密度均是Hyclone 的0.88 倍。因此，添加水解乳蛋白對BHK 和Vero 細胞生長有明顯的促進作用，且自制樣品和Hyclone 產品相差不明顯。

表5 細胞計數結果Table 5 Cell count result

2.3.2 細胞形態圖

圖3 水解乳蛋白培養BHK 和Vero 細胞Fig.3 BHK and Vero cells cultured with lacto-protein hydrolysate

從圖3(細胞整體形態)可看出，添加水解乳蛋白對BHK 和Vero 細胞生長有明顯的促進作用。自制水解乳蛋白和Hyclone 產品差別不明顯。這是因為蛋白水解物在一定條件下可提高細胞活力，促進細胞增殖。

在細胞培養過程中我們發現添加水解乳蛋白濃度過高或過低對細胞增殖的促進作用均有抑制。這是由于濃度過低營養物質未達到最大化;濃度過高時水解乳蛋白中某種抑制細胞生長的氨基酸濃度過大抑制了細胞的生長，或者某些氨基酸的濃度過大使培養基的某些環境發生改變，對細胞的生長產生抑制。

3 結論

水解乳蛋白制備的最優工藝為:復合蛋白酶(胰酶∶中性蛋白酶=2∶1)，40 ℃，pH 7.0，E/S=1∶5(重量比)水解6 h。在此工藝條件下，氨基氮含量3.21 g/L，多肽含量35.63 g/L，噴干收率(以酪蛋白計)達40.20%。自制水解乳蛋白對兩種細胞有明顯促進作用，且與Hyclone 產品差異不明顯。這為細胞培養用水解乳蛋白的大規模生產奠定了基礎。

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