虎耳草的化學成分及生物活性研究

先 春，黃志金，周 欣*，龔小見，趙 超，楊占南

1貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室;2 貴州師范大學天然藥物質量控制研究中心，貴陽 550001

虎耳草(Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.)為虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草屬多年生常綠草本植物，又名金絲荷葉、耳朵紅、老虎草、爛耳草、天荷葉等。收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》2003 年版，是貴州特色苗藥材，資源豐富。全草入藥;微苦、辛，寒，有小毒;祛風清熱，涼血解毒［1-2］。近年來，已有報道虎耳草的乙醇提取物中含有多元酚、黃酮、有機酸等成分［3-5］;虎耳草提取物對前列腺癌細胞有誘導凋亡的作用［6］，乙醇提取物有抑菌作用［7］，以及其活性成分槲皮素等對人胃腺癌細胞的增殖具有抑制作用［8］等功效。從目前的研究現狀看，為進一步探索虎耳草活性部位的活性成分，對綜合利用和評價虎耳草的藥用植物資源具有重要的科學意義。

1 儀器與材料

北京泰克儀器有限公司生產的X-4 型雙目鏡顯微熔點測定儀(溫度計未校正);美國Varian 公司生產的INOVO 400 MHz 型核磁共振譜儀，以TMS 為內標;美國惠普公司生產的HPMS 5973 質譜儀;德國布魯克光譜儀器公司生產的TENSOR 27 紅外儀。柱色譜硅膠(200～300 目，300～400 目)，薄層用硅膠GF254和薄層用硅膠H 均由青島海洋化工廠生產;Sephadex LH-20 凝膠由Pharmacia 公司提供;溶劑均為工業純(重蒸)。虎耳草采集于貴州省都勻市，原植物經貴陽中醫學院陳德媛教授鑒定為虎耳草(Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.)，標本保存于貴州師范大學天然藥物質量控制研究中心。

2 提取與分離

選取虎耳草全草25 kg(干燥)，粉碎后用80%乙醇熱回流提取3 次(每次2 h)，合并提取液后濃縮至無醇味并回收乙醇，浸膏依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分，各部分的浸膏分別為:400，300，400 g。本研究主要對虎耳草乙酸乙酯部分進行分離純化，首先用200～300 目硅膠以石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～1∶1)，氯仿∶甲醇(30∶1～0∶1)梯度洗脫分段。合并后分得四個部分，即石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～15∶1)部分;石油醚∶乙酸乙酯(15∶1～0∶1)部分;氯仿∶甲醇(30∶1～20∶1)部分和氯仿∶甲醇(20∶1～0∶1)部分。棄去第一部分(油脂)和第四部分(大極性)，合并二、三部分以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1～1∶1)，氯仿∶甲醇(30∶1～2∶1)經硅膠柱色譜梯度洗脫，分離純化得到化合物原兒茶酸(1)(50 mg)，琥珀酸(2)(40 mg)，樺木酸(3)(50 mg)，原兒茶酸甲酯(4)(60 mg)。再次合并二、三部分后經凝膠柱色譜以氯仿∶甲醇(5∶1～0∶1)梯度洗脫，得到化合物5，7-二羥基色原酮(5)(10 mg)，槲皮素3-O-β-L-鼠李糖苷(6)(40 mg)，槲皮素5-O-β-D-葡萄糖苷(7)(1.5 g)。虎耳草正丁醇部分以甲醇∶水(1∶0～0∶1)經聚酰胺柱純化后用薄層顯色合并、各段再經MCI、凝膠柱色譜以氯仿∶甲醇(5∶1～1∶1)反復純化，得到化合物1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S，3S，4R，8E/Z)-2-［(2' R)-2'-hydroxytetracosanoylamino)］-8-octadecene-1，3，4-triol(8)(20 mg)。

3 結構鑒定

化合物1 白色針晶(甲醇)，C7H6O4;mp:195～197 ℃。EI-MS m/z:154［M］+，137，109，81.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.41(1 H，s，H-2)，7.40(1 H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.78(1 H，d，J=8.0 Hz，H-5).13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.5(C-1)，116.3(C-2)，144.7(C-3)，150.2(C-4)，114.4(C-5)，121.7(C-6)，168.9(C-7)。上述數據與文獻［9］報道基本一致，故鑒定該化合物為3，4-二羥基苯甲酸(3，4-dihydroxy benzoic acid)，別名原兒茶酸。

化合物2 白色晶體(甲醇)，C4H6O4;mp:185～187 ℃。EI-MS m/z:118［M］+，100，74，55，45.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:2.69(4 H，s，CH2×2)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:175.4(COOH)，29.1(-CH2)。上述數據與文獻［3］報道基本一致，故鑒定化合物為琥珀酸(amber acid)。

化合物3 白色無定形粉末，C30H48O3;mp:278～279 ℃。EI-MS m/z:456［M］+，248，207，175，107，65，43.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:4.69(1 H，s，H-29a)，4.58(1 H，s，H-29b)，1.68(3 H，s，H-30)，0.99(3 H，s，H-23)，0.95(3 H，s，H-24)，0.93(3 H，s，H-25)，0.84(3 H，s，H-26)，0.73(3 H，s，H-27).13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:38.6(C-1)，27.3(C-2)，78.3(C-3)，38.7(C-4)，55.5(C-5)，18.1(C-6)，34.2(C-7)，40.6(C-8)，50.40(C-9)，36.8(C-10)，20.7(C-11)，25.5(C-12)，38.3(C-13)，42.2(C-14)，29.5(C-15)，32.0(C-16)，56.2(C-17)，26.6(C-18)，48.2(C-19)，150.6(C-20)，30.3(C-21)，37.0(C-22)，26.7(C-23)，15.4(C-24，-26)，15.4(C-25)，14.8(C-27)，179.4(C-28)，18.2(C-29)，108.9(C-30)。上述數據與文獻［10］報道基本一致，故鑒定該化合物為樺木酸(betulinic acid)。

化合物4 白色無定形粉末，C8H8O4;mp:132～134 ℃。EI-MS m/z:168［M］+，153，125，97.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.68(1 H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6)，7.53(1 H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.82(1 H，d，J=7.8 Hz，H-5)，3.90(3 H，s，-OCH3)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:121.7(C-1)，112.4(C-2)，147.3(C-3)，151.3(C-4)，114.5(C-5)，123.9(C-6)，168.7(C-7)，55.0(OCH3)。上述數據與文獻［11］報道基本一致，故鑒定該化合物為3，4-二羥基苯甲酸甲酯(3，4-Dihydroxybenzoic acid methyl ester)，別名原兒茶酸甲酯。

化合物5 黃色針晶(甲醇)，C9H6O4;mp:256～267 ℃。EI-MS m/z:178［M］+，150，109，69.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.97 (1 H，d，J=6.0 Hz，H-2)，6.32(1 Hd，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1 H，d，J=6.0 Hz，H-3)，6.05 (1 H，d，J=2.0 Hz，H-6)，.13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:156.8(C-2)，110.3(C-3)，182.0(C-4)，162.1(C-5)，98.9(C-6)，164.8(C-7)，93.8(C-8)，158.5(C-9)，105.2(C-10)。上述數據與文獻［12］報道基本一致，故鑒定該化合物為5，7-二羥基色原酮(5，7-Dthydroxychromone)。

化合物6 黃色粉末，C21H20O11;mp:166～168℃。IR (KBr):υmaxcm-1:3410，1652，1455，1360，1271，1201，1168，964，917.ESI-MS m/z:447［MH］-，471［M+Na］+，302，273，153，137.1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ:12.64 (1 H，s，5-OH)，7.29(1 H，s，H-2')，7.24(1 H，d，J=8.4 Hz，H-6')，6.84(1 H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.38(1 H，s，H-6)，6.19(1 H，s，H-8).13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ:156.5(C-2)，134.2(C-3)，177.8(C-4)，161.3(C-5)，98.7(C-6)，164.2(C-7)，93.7(C-8)，157.4(C-9)，104.1(C-10)，120.8(C-1')，115.8(C-2')，145.2(C-3')，148.5(C-4')，115.5(C-5')，121.2(C-6')，101.8(C-1'')，70.4(C-2'')，70.6(C-3'')，71.2(C-4'')，70.1(C-5'')，17.5(C-6'')。上述數據與文獻［13］報道基本一致，故鑒定該化合物為槲皮素3-Oβ-L-鼠 李 糖 苷(Quercetin 3-O-β-L-rhamnopyranoside)。

化合物7 黃色粉末，C21H20O12;mp:256～267℃。IR (KBr):υmaxcm-1:3397，1623，1559，1457，1334，1276，1075，992，924.ESI-MS m/z:463［MH］-，487［M+Na］+，302，273，153，137.1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:10.95 (1 H，s，7-OH)，9.56(1 H，s，3-OH)，7.64(1 H，s，H-2')，7.50(1 H，d，J=7.6 Hz，H-6')，6.87(1 H，d，J=7.6 Hz，H-5')，6.73(1 H，s，H-8)，6.63(1 H，s，H-6)，4.77(1 H，s，H-1'').13C NMR(C5D5N，100 MHz)δ:143.6(C-2)，137.4(C-3)，171.8(C-4)，158.5(C-5)，103.1(C-6)，162.5(C-7)，97.3(C-8)，157.2(C-9)，106.4(C-10)，122.1 (C-1')，114.8 (C-2')，145.1 (C-3')，147.4(C-4')，115.7(C-5')，119.6(C-6')，103.9(C-1'')，73.8(C-2'')，75.7(C-3'')，69.7(C-4'')，77.6(C-5'')，60.8(C-6'')。上述數據與文獻［14］報道基本一致，故鑒定該化合物為槲皮素5-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin 5-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物8 白色無定型粉末，C48H93NO10;IR(KBr):υmaxcm-1:3417，2923，1633，1405，1199，1100。ESI-MS m/z:842［M-H］-，882［M+K］+.1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:8.58(1 H，d，J=9.2 Hz，-NH)，5.50(2 H，m，H-8)，5.29(1 H，m，H-2)，4.95(1 H，d，J=8.0 Hz，H-1'')，4.71(1 H，m，H-1b)，4.57(1 H，m，H-2')，4.52(各1 H，m，H-1a)，4.34(1 H，m，H-6''b)，4.29(1 H，m，H-6''a)，4.18～4.20(3 H，m，H-4，3''，4'')，3.99(1 H，t，J=8.0 Hz，H-2'')，3.86(1 H，m，H-5'')，1.23～1.30((CH2)n，brs)，0.85(6 H，t，J=6.8 Hz，CH3×2);13C NMR(C5D5N，100 MHz)δ:70.5(C-1)，51.7(C-2)，75.9(C-3)，72.4(C-4，2')，33.9(C-5)，26.7(C-6)，27.6(C-7Z)，32.2(C-7E)，130.4(C-8Z)，130.9(C-8E)，130.2(C-9Z)，130.7(C-9E)，28.0(C-10Z)，33.1(C-10E)，34.0(C-11)，33.4(C-12)，175.8(C-1')，35.6(C-3')，25.9(C-4')，26.8～30.2(C-5'～22'和C-13～16)，23.0(C-17，23')，14.4 (C-18，24')，105.6(C-1'')，75.2(C-2'')，78.5(C-3'')，71.4(C-4'')，78.6(C-5'')，62.6(C-6'')。上述數據與文獻［15］報道基本一致，鑒定該化合物為1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S，3S，4R，8E/Z)-2-［(2'R)-2'-Hydroxytetracosanoylamino)］-8-octadecene-1，3，4-triol。

4 抗前列腺癌細胞的活性測定(MTT法)

細胞增殖檢測［16］(MTT 法測定PC-3 前列腺癌細胞增殖)調整細胞密度為5 ×104·mL-1，接種在96 孔培養板上，每孔200 μL，每組三個復孔，各組加入不同濃度藥物培養48 h，72 h 于培養結束前4 h加入MTT(1 mg/mL)20 μL。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩后在酶標儀490 nm 波長測定OD 值，并做t 檢驗，計算細胞生長抑制率［17］，結果見表1。

表1 虎耳草不同化合物對PC-3 前列腺癌細胞凋亡的影響()Table 1 Different compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on PC-3 prostate cancer cell apoptosis()

表1 虎耳草不同化合物對PC-3 前列腺癌細胞凋亡的影響()Table 1 Different compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on PC-3 prostate cancer cell apoptosis()

結果顯示，槲皮素3-O-β-L-鼠李糖苷(化合物6)和槲皮素5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物7)對PC-3 前列腺癌細胞的生長有一定的抑制作用。

5 抑菌活性研究

5.1 試劑、材料與菌種

試劑:DMSO 等均為分析純。

材料:M-H 培養基、營養瓊脂購于杭州微生物試劑廠，慶大霉素等。

菌種:大腸桿菌(CMCC 44113)、枯草芽孢桿菌(CMCC 63501)、傷寒沙門氏菌(CMCC 50071)、金黃色葡糖球菌(CMCC 26112)、銅綠假單胞菌(CMCC 10211)、藤黃八疊球菌(CMCC 28001)，［菌種均購自中國菌種保藏中心］。

5.2 試驗方法

采用平板打孔法，選用內徑6 mm，外徑7 mm的牛津杯，選用處于對數生長期的試驗菌種，細胞密度為1.0 ×106～1.0 ×108個/mL，試驗樣品用二甲基亞砜(DMSO)試劑溶解。樣品準確稱取5 mg，用0.5 mL DMSO 溶解，濃度配制為:10 mg/mL，每孔加入樣品溶液40 μL。選用DMSO 為空白對照，慶大霉素為陽性對照，每孔加入慶大霉素也為40 μL。在枯草芽孢桿菌實驗中的濃度0.025 mg/mL，在其余五種菌的實驗中濃度為0.25 mg/mL，通過觀察各種抑菌圈的半徑，得出抑菌效果，結果見表2。

5.3 抑菌作用實驗結果及結論

表2 虎耳草不同浸膏及化合物的抑菌活性篩選Table 2 Different extracts and compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on antibacterial activity screening

抑菌實驗研究發現:虎耳草80%醇提物的乙酸乙酯萃取部分對枯草芽孢桿菌抑菌圈大小為12.36±1.60、對金黃色葡糖球菌抑菌圈大小為12.58 ±1.60、對藤黃八疊球菌抑菌圈大小為11.78 ±1.60，由此說明虎耳草乙酸乙酯萃取部位具有潛在的抑菌作用。其中，化合物2(琥珀酸)對枯草芽孢桿菌抑菌圈大小為8.87 ± 0.72，表明此化合物對枯草芽孢桿菌有潛在的抑制作用。

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