紅花的化學成分及DPPH 自由基清除活性研究

Olaleye Olajide，李珊珊，劉海濤，柴 欣，王躍飛*，高秀梅

1天津中醫藥大學中醫藥研究院天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193;2天津國際生物醫藥聯合研究院中藥新藥研發中心，天津 300457

紅花為菊科紅花屬植物紅花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花，是活血通經、祛瘀止痛之良藥?，F代藥理學研究表明，紅花具有擴張血管、增加血流量、改善微循環和抑制血小板聚集等作用，其主要有效成分為黃酮類［1］。為了闡明紅花的化學物質基礎，尋找其活性成分，本課題較為系統地研究了紅花的化學成分，并采用TLC-DPPH 生物自顯影法對紅花提取物各萃取部位及單體化合物開展DPPH 自由基清除活性研究，明確了其抗氧化活性的物質基礎。

1 儀器與材料

Bruker AV Ⅲ核磁共振譜儀(瑞士Bruker 公司);A1204 萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);RE-52A 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);TH-Ⅱ型薄層加熱器(上?？普苌萍加邢薰?;ZF-20D 暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);Aglient 1260 制備液相(美國Agilent 公司);LINOMAT5 半自動點樣儀(瑞士CAMAG 公司);薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(瑞士GE Healthcare 公司);D101 大孔吸附樹脂(天津海光化工有限公司);聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);DPPH 試劑(美國Sigma 公司);抗壞血酸(天津市北方天醫化學試劑廠);所用試劑均為分析純。

紅花藥材由步長制藥集團提供，產地新疆，標本存于天津國際生物醫藥聯合研究院化學與分析實驗室。

2 提取與分離

紅花的干燥花10 kg，用95%、50%乙醇各冷浸提取兩次，減壓回收乙醇至無醇味，合并濃縮液并加入適量水混懸，依次用石油醚(沸程60～90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得石油醚萃取物400 g、二氯甲烷萃取物67 g、乙酸乙酯萃取物114 g、水部分1200 g。水部分經D101 大孔樹脂柱分離，不同濃度乙醇梯度洗脫，得30%乙醇洗脫部位450 g。乙酸乙酯萃取物經多次硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、聚酰胺柱色譜及制備液相分離，得到化合物1 (8.3 mg)、2 (22.2 mg)、3 (31.5 mg)、4 (12.1 mg)、5 (12.4 mg)、6 (10.5 mg)、9 (4.5 mg)、10(31.1 mg)、11 (25.6 mg)、12 (5.7 mg)、13 (6.5 mg)、14 (60 mg)。水部分30%乙醇洗脫部位經多次凝膠柱色譜及制備液相分離，得到化合物7 (5.5 mg)、8 (11.9 mg)。

3 結構鑒定

化合物1 淡黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:11.82(1H，s，4-OH)，11.66 (1H，s，H-1)，7.91 (1H，s，H-9)，7.70 (1H，s，H-6)，2.49 (3H，s，H-11)，2.47(3H，s，H-12);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:150.1(C-2)，160.7 (C-4)，125.9 (C-6)，141.7 (C-7)，138.4 (C-8)，128.8 (C-9)，20.3 (C-11)，19.7 (C-12)，144.7 (C-1a)，130.3 (C-4a)，146.5 (C-5a)，138.9 (C-9a)。其理化性質及波譜數據與文獻［2］報道相符，故鑒定化合物1 為異光黃素(isolumichrome)。

化合物2 白色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.24(1H，s，5-OH)，9.58 (1H，s，4'-OH)，7.31 (2H，d，J=8.4Hz，H-2'，6')，6.79 (2H，d，J=8.4Hz，H-3'，5')，5.96 (1H，s，H-8)，5.43 (1H，dd，J=12.8，2.8 Hz，H-2)，4.63 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″)，3.28(1H，m，H-3ax)，2.68 (1H，dd，J=17.2，2.8Hz，H-3eq);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:79.0 (C-2)，42.5 (C-3)，197.5 (C-4)，102.3 (C-4a)，155.5 (C-5)，126.7 (C-6)，159.8 (C-7)，95.5 (C-8)，159.1(C-8a)，129.3 (C-1')，128.8 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，158.2 (C-4')，105.2 (C-1″)，74.3 (C-2″)，76.6 (C-3″)，70.0 (C-4″)，77.7 (C-5″)，61.2 (C-6″)。其理化性質及波譜數據與文獻［3］報道相符，故鑒定化合物2 為(2S)-4'，5，6，7-四羥基二氫黃酮-6-O-β-D-葡萄 糖苷((2S)-4'，5，6，7-tetrahydroxyflavanone 6-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物3 亮黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:7.30(2H，d，J=8.4Hz，H-2'，6')，6.79 (2H，d，J=8.4Hz，H-3'，5')，5.85 (1H，s，H-8)，5.38 (1H，dd，J=12.8，2.8 Hz，H-2)，4.56 (1H，d，J=8.0 Hz，H-1″)，3.21 (1H，m，H-3ax)，2.64 (1H，dd，J=16.8，3.0 Hz，H-3eq);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:78.8(C-2)，42.5 (C-3)，196.5 (C-4)，101.3 (C-4a)，159.2 (C-5)，129.5 (C-6)，158.1 (C-7)，96.0 (C-8)，155.3 (C-8a)，127.4 (C-1')，128.7 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，158.1 (C-4')，105.7 (C-1″)，74.4(C-2″)，76.8 (C-3″)，70.0 (C-4″)，77.7 (C-5″)，61.2 (C-6″)。其理化性質及波譜數據與文獻［4］報道相符，故鑒定化合物3 為新紅花苷 (neocarthamin)。

化合物4 黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ:8.10(2H，d，J=8.6 Hz，H-2'，6')，6.92 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，5')，6.41 (1H，s，H-8)，6.20 (1H，s，H-6);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ:146.6 (C-2)，135.7 (C-3)，176.0 (C-4)，156.9 (C-5)，97.9 (C-6)，164.2 (C-7)，93.1 (C-8)，161.1 (C-9)，103.2(C-10)，122.3 (C-1')，129.3 (C-2'，6')，114.9 (C-3'，5')，159.2 (C-4')。其理化性質及波譜數據與文獻［5］報道相符，故鑒定化合物4為山柰酚(kaempferol)。

化合物5 亮黃色塊狀晶體(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.62 (1H，brs，5-OH)，10.25 (2H，brs，7，4'-OH)，8.04 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.43 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.46 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.9 (C-2)，133.6 (C-3)，177.9 (C-4)，161.7 (C-5)，99.2(C-6)，164.7 (C-7)，94.1 (C-8)，156.7 (C-9)，104.4 (C-10)，121.4 (C-1')，131.4 (C-2'，6')，115.6 (C-3'，5')，160.4 (C-4')，101.3 (C-1″)，74.7(C-2″)，76.9 (C-3″)，70.4 (C-4″)，78.0 (C-5″)，61.3 (C-6″)。其理化性質及波譜數據與文獻［6］報道相符，故鑒定化合物5 為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol 3-O-β-D-glucoside)。

化合物6 亮黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.57(1H，s，5-OH)，10.86 (1H，brs，7-OH)，10.13 (1H，brs，4'-OH)，7.99 (2H，d，J=8.8 Hz，2'，6'-H)，6.88(2H，d，J=8.8 Hz，3'，5'-H)，6.41 (1H，d，J=2.0 Hz，8-H)，6.20 (1H，d，J=2.0 Hz，6-H)，5.31 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，4.38 (1H，brs，H-1''')，0.99(3H，d，J=6.4 Hz，H-6''');13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.2 (C-2)，133.1 (C-3)，177.5 (C-4)，161.0 (C-5)，98.5 (C-6)，163.9 (C-7)，93.8 (C-8)，156.9 (C-9)，104.0 (C-10)，120.9 (C-1″)，130.7 (C-2″，6″)，115.1 (C-3″，5″)，160.0 (C-4″)，101.9 (C-1″)，74.2 (C-2″)，76.4 (C-3″)，69.9 (C-4″)，75.7 (C-5″)，66.9 (C-6″)，100.8 (C-1″')，70.3(C-2″')，70.6 (C-3″')，71.8 (C-4″')，68.3 (C-5″')，17.8 (C-6'″)。其理化性質及波譜數據與文獻［6］報道相符，故鑒定化合物6 為山柰酚-3-O-β-蕓香糖苷(kaempferol 3-O-β-rutinoside)。

化合物7 暗黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.24(1H，s，5-OH)，8.03 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.92 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.53 (1H，s，H-8)。其理化性質及波譜數據與文獻［7］報道相符，故鑒定化合物7 為6-羥基山柰酚(6-hydroxykaempferol)。

化合物8 暗黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.42(1H，s，5-OH)，10.51 (1H，brs，7-OH)，10.13 (1H，brs，4'-OH)，8.77 (1H，brs，6-OH)，8.03 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5')，6.53 (1H，s，H-8)，5.46 (1H，d，J=7.6 Hz，H-1″);13C NMR (100 MHz，DMSO)δ:156.6 (C-2)，133.3 (C-3)，178.0 (C-4)，146.9 (C-5)，129.5 (C-6)，154.0 (C-7)，94.0 (C-8)，149.4 (C-9)，104.8(C-10)，121.6 (C-1')，131.3 (C-2'，6')，115.5 (C-3'，5')，160.3 (C-4')，101.5 (C-1″)，74.7 (C-2″)，76.9 (C-3″)，70.4 (C-4″)，77.9 (C-5″)，61.3 (C-6″)。其理化性質及波譜數據與文獻［7］報道相符，故鑒定化合物8 為6-羥基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(6-hydroxykaempferol 3-O-β-D-glucoside)。

化合物9 亮黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯黃色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.49(1H，s，5-OH)，10.77 (1H，brs，7-OH)，9.58 (1H，brs，4'-OH)，9.35 (1H，brs，3'-OH)，9.30 (1H，brs，3-OH)，7.68 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2')，7.54 (1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6')，6.88 (1H，d，J=8.8 Hz，H-5')，6.41 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。其理化性質及波譜數據與文獻［8］報道相符，故鑒定化合物9 為槲皮素(quercetin)。

化合物10 白色針狀晶體(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不顯色。1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ:7.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.84 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)。其理化性質及波譜數據與文獻［9］報道相符，故鑒定化合物10 為對羥基苯甲酸 (phydroxybenzoic acid)。

化合物11 白色塊狀晶體(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液顯紫色。1H NMR (400 MHz，CD3OD)δ:7.62(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，7.48 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.82 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.30(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)。其理化性質及波譜數據與文獻［9］報道相符，故鑒定化合物11 為對羥基桂皮酸(p-hydroxycinnamic acid)。

化合物12 淡黃色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不顯色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:10.91(2H，brs，-NH)，7.39 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.45(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)。其理化性質及波譜數據與文獻［2］報道相符，故鑒定化合物12 為尿嘧啶(uracil)。

化合物13 白色粉末(甲醇)，5%硫酸乙醇溶液不顯色。1H NMR (400 MHz，DMSO)δ:12.77(1H，brs，9-NH)，8.11 (1H，s，H-2)，8.09 (1H，s，H-8)，7.07 (2H，brs，6-NH2)。其理化性質及波譜數據與文獻［10］報道相符，故鑒定化合物13 為腺嘌呤(adenine)。

化合物14 白色針狀晶體(氯仿)，5%硫酸乙醇溶液顯紫紅色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ:5.37(1H，brd，J=5.2 Hz，H-6)，3.59～3.54 (1H，m，H-3)，1.03 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.87 (3H，t，J=7.6 Hz，H-29)，0.86 (3H，d，J=7.6 Hz，H-26)，0.84 (3H，d，J=7.2 Hz，H-27)，0.71 (3H，s，H-18)。其理化性質及波譜數據與文獻［11］報道相符，故鑒定化合物14 為β-谷甾醇(βsitosterol)。

4 DPPH 自由基清除活性研究

4.1 樣品的制備

分別稱取適量抗壞血酸(Vc)、紅花提取物的二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、水層樣品、分離得到的14 個單體化合物，甲醇溶解，配制成濃度為2 mg/mL 的樣品溶液，依次稀釋5 倍，得到濃度為0.4 和0.08 mg/mL 的樣品溶液。稱取DPPH50 mg，用無水乙醇溶解于50 mL 棕色容量瓶中，得到0.1% (w/v)DPPH 無水乙醇溶液。

4.2 實驗方法

將高(2 mg/mL)、中(0.4 mg/mL)、低(0.08 mg/mL)濃度樣品溶液分別點樣于薄層硅膠板，以Vc 為陽性對照，甲醇為空白對照，每個樣品點樣量3 μL。溶劑揮干后，將0.1%DPPH 無水乙醇溶液均勻噴于硅膠板上，30 min 后觀察顯色結果，共重復三次。

圖1 DPPH 處理前后的點樣薄層板Fig.1 TLC result before and after dealing with DPPH

4.3 實驗結果與討論

如圖1 所示:紅花乙醇提取物乙酸乙酯萃取物、二氯甲烷萃取物具有明顯的DPPH 自由基清除活性，水層活性較弱。以Vc 為陽性對照，從乙酸乙酯萃取物中分離到的化合物4 (山柰酚)、9 (槲皮素)、11 (對羥基桂皮酸)具有明顯的DPPH 自由基清除活性，化合物2 ((2S)-4'，5，6，7-四羥基二氫黃酮-6-O-β-D-葡萄糖苷)、3 (新紅花苷)、5 (山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷)、6 (山柰酚-3-O-β-蕓香糖苷)、10 (對羥基苯甲酸)及從水層分離得到的化合物7(6-羥基山柰酚)、8 (6-羥基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷)具有一定的DPPH 自由基清除活性，而化合物1(異光黃素)、12 (尿嘧啶)、13 (腺嘌呤)、14 (β-谷甾醇)未顯示DPPH 自由基清除活性。

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