素馨花提取物橄欖苦苷在大鼠體內藥代動力學研究

郝 婷，尹營松，李亞洲，劉麗艷，陳四平，趙桂琴

1承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德 067000;2 河北師范大學藥物研究所，石家莊 050011

橄欖苦苷是一種裂環環烯醚萜苷類化合物，作者從素馨花(Jasminum officinale L.var.grandiflorum)70%乙醇提取物中分離得到。該物質體內外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性明確，在素馨花藥材中含量豐富(初步估算超過5%)［1］，易于分離純化，有望成為新型抗HBV 活性先導化合物。本文建立了測定橄欖苦苷含量的HPLC 方法，并應用該方法對橄欖苦苷在大鼠體內的藥代動力學過程進行了研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑

甲醇(色譜純，Dikmapure);甲醇(分析純，天津賽孚試劑廠);甲酸(分析純，天津市佳興化工廠);市售純凈水;橄欖苦苷(實驗室自制，純度大于98%);內標物黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-201016)。

1.2 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(HPLC);HC-2062 高速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司);梅特勒-托利多AG245 型分析天平(瑞士);KQ-100E 超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠120 只，體重180～200 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證:0237506。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱;流動相:水-甲醇-甲酸(63∶37∶1);檢測波長:276 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。

2.2 給藥及樣品采集

根據預實驗結果，確定大鼠灌胃低、中和高劑量分別為100、200 和400 mg/kg。取Wistar 大鼠120只，隨機分成低、中、高劑量組，每組40 只給藥前12h 禁食，自由飲水。將橄欖苦苷配制為相應濃度的溶液，i.g.給藥，給藥容積為10 mL/kg，給藥后自由飲水，分別于i.g.后5、10、15、30、60、120、240、480 min 采用400 μL 一次性負壓采血管(肝素鈉抗凝)，腹主動脈取血400 μL(每個時間點5 只)，于2500 rpm 離心15 min，分離血漿，-20 ℃保存。

2.3 血漿樣品預處理［2-5］

精密吸取空白血漿100 μL，依次加入1 mol/L磷酸二氫鉀溶液50 μL 及5 μL 內標物，渦旋20 s，依次加入甲醇100 μL，乙腈350 μL，渦旋5 min，超聲20 min，3000 rpm 離心，取上清液，40 ℃氮氣揮干，殘渣用500 μL 流動相復溶，14000 rpm 離心，取上清液，進樣20 μL，HPLC 法測定。

2.4 血漿樣品中橄欖苦苷標準曲線的制備

精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度橄欖苦苷系列標準溶液25 μL 和0.12 mg/mL 的內標溶液5 μL，配置成橄欖苦苷血漿標準系列，濃度分別為5.25、10.5、16.75、21、26.25、52.5 μg/mL，每一濃度平行配置3 份，按“血漿樣品處理”項操作后，取上清液，進樣20 μL，每個樣品進樣3 次，HPLC 測定，記錄峰面積，取平均值。

2.5 精密度與準確度

制備橄欖苦苷低、中、高3 個濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)為質量控制(QC)樣品，每個濃度平行處理5 份，按照“血漿樣品處理”項操作，每個樣品測定一次，于一個工作日內完成，計算日內精密度。同樣的QC 樣品連續重復3 d，計算日間精密度。

2.6 方法回收率的測定

制備橄欖苦苷低、中、高3 個濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)為質量控制(QC)樣品，按“血漿樣品處理”項操作，以提取后的色譜峰面積與內標溶的峰面積比值帶入回歸方程，所得濃度與實際濃度的比值即為方法回收率。

2.7 穩定性試驗

考察橄欖苦苷低、中、高3 個濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 樣品的穩定性，以橄欖苦苷的峰面積為指標，血漿樣品處理后，4 ℃放置3 d，HPLC檢測，記錄峰面積。

2.8 數據分析

灌胃給藥后橄欖苦苷的血藥濃度-時間數據用3P97 藥代動力學軟件分析。組間藥動學參數用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。

3 結果

3.1 血漿樣品中橄欖苦苷的標準曲線

以血漿樣品中橄欖苦苷濃度為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值為縱坐標，求得橄欖苦苷標準曲線為y=0.0442x-0.038(R2=0.9991)，線性范圍5.25～52.5 μg/mL，信噪比S/N=3 時定量限為5.25 μg/mL。

3.2 精密度與準確度

血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的日內、日間精密度RSD 值均小于±5%，準確度RE 值均小于±10%，其中，血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的日內峰面積RSD 分別為1.96%、2.34%、1.87%;血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷日間峰面積RSD 分別為2.89%、3.67%、2.96%。

3.3 方法回收率的測定

血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的提取回收率分別為96.9%、98.2%、102.7%。

3.4 穩定性試驗

血漿中橄欖苦苷低、中、高3 個濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 樣品的穩定性，以橄欖苦苷的峰面積為指標，血漿樣品處理后，4 ℃放置3 d，橄欖苦苷的RSD 分別為7.1%、8.4%、3.92%。

3.5 藥時曲線及藥代動力學參數

大鼠灌胃給予低、中、高3 個劑量橄欖苦苷后的平均血藥濃度-時間曲線(圖2)，所得實驗數據用3P97 藥代動力學軟件進行處理，所得藥動學參數見表1，經3P97 軟件擬合，體內藥代動力學過程符合二室模型，結果顯示半衰期t1/2分別為15.189、32.829、55.097 min，清除率CL/F 分別為0.0174、0.0526、0.0653 μg/(μL·min)，隨劑量的增大而延長，藥物濃度-時間曲線下面積AUC 分別為5759.51、3804.57、6250.72 μg/(min·μL)，隨劑量的增大先減小后增大，顯示出非線性藥代動力學特征

表1 大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷藥動學參數(n=5，)Table 1 Main pharmacokinetic parameters of oleuropein after i.g.administration of different dose of oleuropein extract to rats (n=5，)

注:與中、高劑量組比較，* P ＜0.05。Note:Compare with middle，high dose group，* P ＜0.05.

圖1 大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷體內的平均藥時曲線Fig.1 Mean plasma concentration-time curve of oleuropein after i.g.administration

4 討論

由于大鼠個體間存在差異可能導致數據偏差，本實驗中的大鼠均采用完全隨機法進行分組。取各組大鼠血藥濃度的平均值，用3P97 藥動學軟件處理數據，求出藥動學參數，盡可能減少由于大鼠個體差異所造成的數據偏差。

研究結果表明，大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷時，橄欖苦苷的t1/2隨給藥劑量增大而顯著延長，AUC先減小后增大，推測橄欖苦苷在大鼠體內為非線性動力學過程［6］。

實驗結果顯示，中、高劑量組(200 mg/kg 和400 mg/kg)大鼠血漿的藥時曲線出現雙峰現象，而低劑量組(100 mg/kg)未出現雙峰現象。藥物的吸收出現多峰現象存在多種原因，如肝腸循環、多部位吸收、體內再分布等。中、高劑量組的雙峰現象可能是因為橄欖苦苷在大鼠體內的藥代動力學存在肝腸循環，或快速分布至其它臟器后再次吸收入血。相關研究有待深入進行。

本實驗也做了方法專屬性考察，結果表明血漿中內源性雜質不干擾橄欖苦苷的含量測定，內標物與橄欖苦苷分離完全，峰形良好，該方法適用于本實驗。

本研究均按照2010 版藥典的附錄XIX B，即生物樣品分析方法的基本要求，進行操作［7］，符合國內檢測標準。

1 Zhao GQ(趙桂琴).Studies on the chemical constituents and anti-HBV activity of Jasminum officinale L.var.grandiflorum.Beijing:Academy of Military Medical Sciences (軍事醫學科學院)，PhD.2008.

2 Zhao XY(趙緒元)，Yao JC(姚金成)，Hu L(胡領)，et al.Determination of Baicalin of Yinhuan granules in rat plasma by HPLC and study on its pharmacokinetics.Nat Prod Res Dev (天然產物研究與開發)，2007，19:645-647.

3 Zhang Y(張楊)，Zhang ZQ(張振秋)，Sun ZS(孫兆姝)，et al.Pharmacokinetic of berberine in combination of Cortex Phellodendri and Rhizoma atractrylodis in rat.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2009，31:1351-1354.

4 Tian JZ(田景振)，Wei FH(魏鳳環).Study on pharmacokinetics of puerarin sustained-release capsules in rabbits after intravenous administration.J Shandong Univ Tradit Chin Med (山東中醫藥大學學報)，2003，27:4542-4561.

5 Deng XG(鄧新國)，Hu SX(胡世興)，Zhang QJ(張清炯)，et al.Pharmacokinetic study of puerarin in aqueous humor of rabbits following intraperitoneal injection.Chin Ophth Res(眼科研究)，2003，21:2582-2601.

6 Liu YM(劉亦明)，Lin AH(林愛華)，Chen H(陳匯)，et al.Study on pharmacokinetics of scutellarin in rabbits.Acta Pharm Sin(藥學學報)，2003，38:775-778.

7 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Appendix XIX B.