一株鏈霉菌產生的抗腫瘤活性產物

蔣秋龍，楊志鈞，饒 敏，戈 梅，錢秀萍*

1上海交通大學藥學院;2 上海來益生物藥物研究開發中心，上海 200240

鏈霉菌是一類具有絲狀分枝細胞的革蘭氏陽性細菌，與其他細菌相比具有較為復雜的發育分化過程，而其形態分化的同時又伴隨著復雜的生理變化和大量次級代謝產物的生成［1］。鏈霉菌除了產生臨床上應用的大部分抗生素外，還包括抗腫瘤活性產物如Lee［2］等從Streptomyces sp.KACC91015 中分離到的苯二羥基辛烯酮衍生物對腫瘤細胞有抗增殖作用，酶抑制劑如Shin-ya［3］等從S.anulatus 中分離得到telomestatin，該物質是一種強效特異的端粒酶抑制劑，殺蟲劑如Lewer［4］等從Streptomyces CP1130分離得到tartrolone C 對舔菜夜蛾具有中等的殺蟲作用等等，因此研究鏈霉菌代謝產物具有重要的意義。作者在一株鏈霉菌屬的放線菌發酵液中，分離出2 個新化合物和4 個已知化合物(圖1)，且兩個新化合物都具有一定的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Master cycler epgradient PCR 儀(Eppendorf);Heidoldf Laborata-4000 旋轉，蒸發儀;硅膠柱色譜300～400 目;戴安液相色譜儀P680(DIONEX);Agilent 1100 型高效液相色譜儀(Agilent);Q-Tofmicro磁式質譜儀(Waters);BrukerAvanceII-400 型超導核磁共振儀，TMS 為內標;JASCO P2000 旋光儀。

1.2 菌種來源

鏈霉菌HCCB11431、金黃色葡萄球菌、乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞PANC-1 和前列腺癌細胞Du-145(菌種和細胞均保藏于上海來益生物藥物研究開發中心)。

圖1 化合物1～6 的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

1.3 菌株HCCB11431 的分子生物學鑒定

采用CTAB 法［5］提取放線菌基因組DNA，提取后用50 μL TER(含RnaseA 20 μg/mL)溶解，以提取的DNA 為模版，利用細菌gyrB 通用引物(gryBPF-1、gryB-PR-2)進行擴增。PCR 擴增條件為:94℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，58 ℃復性30 s，72℃延伸5 min，共30 個循環，最后72 ℃延伸10 min。

將獲得的序列與GenBank 中已發表的gyrB 基因序列進行同源性比較，選取同源性在95%以上的若干菌株，利用MEGA5.0 軟件進行親緣關系和系統發育樹的構建。MEGA 軟件相關參數為:統計方法選擇Neighbor-Joining，Bootstrap 選擇1000，置換法選擇Kimura2-parameter model。

1.4 培養基及發酵條件

種子培養基:葡萄糖20 g，甘油20 g，可溶性淀粉20 g，黃豆餅30 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g 和水1 L;發酵培養基:葡萄糖8 g，黃豆餅粉22 g，玉米淀粉40 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO40.2 g，NaCl 2 g 和水1 L。發酵過程:先將HCCB11431接種于種子培養基中，搖床培養2 d(28 ℃、220 rpm)，再將培養好的種子以8%的接種量接種于5 L的發酵罐中，培養6～7 d。

1.5 產物的分離純化

發酵結束后，用同等體積的甲醇過夜浸泡，離心得上清液，蒸干后得粗品20 g。粗品用甲醇溶解并用硅膠拌樣，氯仿和甲醇體系過硅膠柱，梯度(甲醇濃度10%～90%)洗脫，洗脫液根據TLC 點板和HPLC 分析后合并餾分得到餾分1 和餾分2，蒸干溶劑后復溶于甲醇中。

餾分1 和餾分2 分別用戴安液相色譜儀P680進行分離，制備柱YMC-Pack RP C18(20 mm ×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A 相為超純水，B相為甲醇(色譜純);進樣量:1 mL;0～30 min 用30%～100%甲醇洗脫，流速8 mL/min，得到餾分1-1、1-2、2-1 和2-2。

餾分1-1 經Agilent 1100 制備液相色譜儀分離，半制備柱YMC-Pack RP C18(10 mm × 250 mm，5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A 相為甲酸水(0.05%甲酸)，B 相為甲醇(色譜純);進樣量:20 μL;0～30 min 用30%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物1(tR=28.9 min);餾分1-2 經Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～35 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物3(tR=30.7 min);餾分2-2 經Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物2(tR=22.0 min);餾分2-1 經Agilent 1100制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到餾分2-1-1 和餾分2-1-2;餾分2-1-1 經Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物4(tR=7.9 min)和化合物6(tR=8.5 min);餾分2-1-2 再經Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物5(tR=16.6 min)。

1.6 細胞毒活性測定方法

參照貼壁細胞的MTT 法［6］進行測試。具體方法如下:在96 孔板上，加5 ×104/mL 濃度的測試細胞的懸浮液，每孔90 μL，待細胞貼壁后加入待測樣品10 μL，每個濃度重復3 個孔，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養48 h 后加入20 μLMTT 染料繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入120 μL DMSO 后，等待20 min 后用Bio-Rad680 酶標儀測定OD570。抑制率計算公式如下:

根據計算出的細胞抑制率，用統計學軟件SPSS 11.0 的Probit 回歸法，計算樣品的IC50。

2 結果與分析

2.1 菌株HCCB11431 分子生物學鑒定

gyrB 基因是編碼DNA 促旋酶的亞單位蛋白，對于細菌DNA 的轉錄和復制很重要，是一段較保守的序列，不出現頻繁的基因橫向轉移，因而常常被選用于細菌系統發育分析［7］。測序結果表明HCCB11431 的gyrB 基因含有1229 個核苷酸，GenBank號:KF746164。將HCCB11431 的gyrB 基因序列與GenBank 中相關序列的BLAST 比較，結果顯示HCCB11431 屬于鏈霉菌屬，與Streptomyces labedae 的序列同源性高達99%以上。

利用HCCB11431 的gyrB 基因序列構建系統發育樹(圖2)，由圖可知HCCB11431 與Streptomyces labedae 位于同一分支，同源性很高，在所比對的鏈霉菌中，與Streptomyces labedae 的關系最接近，故該菌株初步鑒定為Streptomyces labedae 菌。

圖2 HCCB11431 的系統發育樹Fig.2 Phylogenic tree of HCCB11431 based on gyrB full-length sequence

2.2 結構鑒定

化合物1 白色粉末，UV (H2O)λmax280(ε1159.85)，。質譜圖顯示其準分子離子峰為m/z 268.1155［M+H］+，分子式為C13H17NO5(理論計算值為268.1185，不飽和度為6);紅外光譜在3440、3423 cm-1上有吸收表明有氨基或羥基的存在，1630 cm-1上的吸收表明有羰基的存在，在1385、1122 cm-1處的吸收表明可能有芳香環的存在。通過分析1H NMR、13C NMR 和HMQC 波譜數據(表1)證實化合物1 含有3 個甲基(1 個連氧的甲基)、1 個亞甲基、1 個連氮的次甲基、1 個四取代的苯環和2 個羰基(δC171.2 和163.2);根據以上數據推得，其分子式和不飽和度要求化合物1 結構中含有1 個羥基和1 個氨基。通過1H-1H COSY 相關譜1 得到1個孤立的C-2– C-3 自旋體。在HMBC 譜(圖3)中，H2-3 與C-4、C-5 和C-9 相關，表明C-3 在苯環的C-4 位取代;H3-13 與C-7、C-8 和C-9 相關，表明C-13 與C-8 相連;H3-12 與C-7 相關，以及考慮C-12的化學位移，C-12 通過氧與苯環上的C-7 相連;H3-11 與C-10 相關，以及考慮到C-6(δC148.9)和C-7(δC144.2)的化學位移，C-11 通過酯健與C-6 相連;H-2 與C-1 相關以及考慮到C-2 的化學位移，剩下的-COOH 和-NH2與C-2 相連。通過以上數據，推出化合物1 的平面結構為三取代苯丙氨酸衍生物，該物質為一新化合物，命名為3-(3-acetoxy-4-methoxy-5-methylphenyl)-2-aminopropanoicacid。化合物1 的化學結構與文獻［8］中報道的已知化合物3-(3-hydroxy-4-methoxy-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid 的結構類似，多了一個乙酯基，其他部分核磁數據基本一致，證明了化合物1 的推測結構符合事實。

表1 化合物1 的核磁數據Table 1 NMR spectroscopic data of 1 (Actone-d6，400 MHz)

圖3 化合物1 的HMBC 關系圖Fig.3 Key HMBC correlations of 1

化合物2 白色粉末，λmax280(ε1226.52)，=-23.21(c 0.2，CH3OH);高分辨正離子電噴霧質譜圖顯示其準分子離子峰為m/z254.1022［M+H］+，分子式為C12H15NO5(理論計算值為254.1028，不飽和度為6)。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-5)，6.47(1H，s，H-9)，4.57(1H，dd，J=8.5，5.3 Hz，H-2)，3.00(1H，dd，J=13.9，5.1 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=13.9，8.7 Hz，H-3β)，1.94(3H，s，H-11)，2.17(3H，s，H-12)。紅外光譜與化合物1 相近，另外通過與化合物1的1H NMR 數據比較發現，氧甲基(δH3.73)在化合物2 中消失外，其它1H NMR 數據基本一致，表明該化合物比化合物1 少了氧甲基，其它結構與化合物1 相同，該物質也為一新化合物，命名為3-(3-acetoxy-4-hydroxyl-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid。化合物2 的化學結構與文獻［8］中報道的已知化合物3-(3，4-hydroxyl-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid的結構類似，多了一個乙酯基，其他部分核磁數據基本一致，從而證實了化合物2 推測的結構是正確的。

化合物3 白色粉末，TOF-MS m/z 252.1081［M+H］+，分子式為C10H13N5O3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:8.19(1H，s，H-2)，8.34(1H，s，H-8)，6.34(1H，dd，J=6.1，8.0 Hz，H-1')，2.28(1H，ddd，J=2.7，6.0，-13.1 Hz，H-2'α)，2.75(1H，ddd，J=5.7，8.0，-13.1 Hz，H-2'β)，4.42(1H，dddd，J=2.6，2.7，4.0，5.7 Hz，H-3')，3.88(1H，ddd，J=2.6，4.2，4.4 Hz，H-4')，3.62(1H，ddd，J=4.4，5.0，-12.0 Hz，H-5'a)，3.52(1H，ddd，J=4.2，6.7，-12.0 Hz，H-5'b)，5.30(1H，d，J=4.0 Hz，OH-3')，5.23(1H，dd，J=5.0，6.7 Hz，OH-5')。以上數據與文獻［9］報道基本一致，故化合物3 確定為2'-deoxyadenosine。

化合物4 白色粉末，TOF-MS m/z 244.0906［M+H］+，分子式為C9H13N3O5。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:3.80(1H，dd，J=12.4，2.4 Hz，H-5')，3.93(1H，dd，J=12.4，2.4 Hz，H-5')，4.09(1H，ddd，J=2.8，3.2，2.4 Hz，H-4')，4.18(1H，dd，J=5.3，5.2 Hz，H-3')，4.21(1H，dd，J=4.8，4.2 Hz，H-2')，6.12(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，5.89(1H，d，J=3.2 Hz，H-1')，8.51(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，以上數據與文獻［10］報道基本一致，故化合物4 確定為Cytidine。

化合物5 白色粉末(CH3OH)，TOF-MS m/z 245.0736［M+H］+，分子式為C9H12N2O6。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.03(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=4.6 Hz，H-1')，5.71(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，4.19(1H，dd，J=6.1，5.0 Hz，H-2')，4.17(1H，dd，J=4.9，4.9 Hz，H-3')，4.03(1H，ddd，J=2.9，3.1，4.0 Hz，H-4')，3.85(1H，dd，J=12.3，2.8 Hz，H-5')，3.75(1H，dd，J=12.3，3.0 Hz，H-5')，以上數據與文獻［11］報道基本一致，故化合物5確定為Uridine。

化合物6 白色粉末，TOF-MS m/z 228.0978［M+H］+，分子式為C9H13N3O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.12(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，6.27(1H，dd，J=6.2，7.6 Hz，H-1')，6.00(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，4.40(1H，d，H-3')，3.98(1H，ddd，J=2.8，8.0 Hz，H-4')，3.85-3.72 (2H，m，H-5'，H-5'')，2.42-2.14(2H，m，H-2'，H-2'')，以上數據與文獻［12］報道基本一致，故化合物6 確定為2'-deoxycytidine。

2.3 活性分析

活性測定結果表明，化合物對不同的腫瘤細胞具有不同的細胞毒活性(表3)。化合物1 和化學物2 是屬于氨基酸衍生物，其中化合物1 只對MCF-7有一定的抑制作用，化合物2 對三種腫瘤細胞均具有較高的抑制作用，推測可能是由于甲基化減弱了細胞毒的緣故。化合物3～6 屬于核苷類似物，其中化合物3 和4 的抗腫瘤活性較強，化合物3 是蟲草素的結構類似物，而蟲草素［13］(cordycepin)是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用。雖然化合物4 和化合物6 同屬于胞苷類似物，但化合物4 的活性明顯較高，說明2'位的羥基是重要的活性位點。

表3 化合物1～6 的IC50結果Table 3 IC50values of compounds 1-6 on tumor cells growth(μg/mL)

3 討論

本實驗分離得到的化合物分別為氨基酸衍生物(1～2)和核苷類似物(3～6)，目前很多研究者將氨基酸進行結構修飾應用于抗腫瘤藥物的篩選，部分氨基酸經過修飾后不僅增加了對腫瘤細胞的靶向性，其抗腫瘤活性也有了提高，毒副反應也有所降低，因此利用氨基酸設計出新的抗腫瘤藥物具有重要意義。在本實驗中，化合物1 和化合物2 在結構上相差一個甲基，即化合物2 苯環上的羥基被甲基化，化合物2 的抗腫瘤活性明顯比化合物1 要高很多，表明化合物2 苯環上的羥基可能是活性位點之一。

核苷類似物結構易改造，生物體內多種分子作用靶標也讓核苷類似物可以通過多種途徑產生抗腫瘤活性。通過構效關系建立模型來指導藥物的合成是目前核苷類抗癌藥物的發展方向之一，本實驗分離出的化合物4 和化合物6 也證明了結構的差異引起了抗腫瘤活性的改變。

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