大孔吸附樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮工藝研究

郭 飛，胡曉旭，雷紅菲，黃 薇，譚 偉，王紅斌*

1云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;3 大理市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)站，大理 671000

無(wú)柄金絲桃［1］(Hypericum augustinii N.Robson)是藤黃科金絲桃屬植物，在云南省主要分布在紅河、文山等地。金絲桃屬植物主要成分有二蒽酮、間苯三酚衍生物、口山酮、黃酮等類(lèi)型的化合物，此外，還含有甾醇、萜類(lèi)、脂肪酸揮發(fā)油等［2］，其主要有鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種藥理活性［3］。黃酮類(lèi)化合物生物活性多樣，具有對(duì)心肌缺血保護(hù)、抗癌、對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的免疫、降血脂、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、降血糖等作用［4］，尤其是近年來(lái)，黃酮類(lèi)化合物在抗病毒(如艾滋病毒、流感病毒等)、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等［5，6］研究中表現(xiàn)出顯著活性。無(wú)柄金絲桃在中藥中以全株入藥，用于治療肝炎和腫痛，其藥效與黃酮類(lèi)化合物藥效有相似之處，因此，純化無(wú)柄金絲桃中總黃酮對(duì)于進(jìn)一步研究無(wú)柄金絲桃的藥理作用有重要意義。

大孔吸附樹(shù)脂［7］在中草藥的有效成分的純化分離中有著廣泛的應(yīng)用［8］，作為一類(lèi)有機(jī)高聚物吸附劑，大孔吸附樹(shù)脂具有物理及化學(xué)特性穩(wěn)定、吸附選擇性好、解吸容易、可反復(fù)利用、操作簡(jiǎn)便、安全、對(duì)有機(jī)物選擇性較好、不受無(wú)機(jī)鹽類(lèi)及低分子化合物的影響等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂純化植物中黃酮類(lèi)化合物的工藝研究［9-11］報(bào)道很多，但對(duì)純化無(wú)柄金絲桃提取物總黃酮很少有報(bào)道，本文將研究大孔吸附樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮工藝條件。

1 材料、試劑與儀器

材料:無(wú)柄金絲桃莖(于2009年8 月采自云南省文山州廣南縣經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所鑒定);樹(shù)脂:D101 樹(shù)脂、S8 樹(shù)脂、AB8 樹(shù)脂、ADS17 樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)提供);試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品及生物制品檢定所)、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純?cè)噭?/p>

儀器:WFJ7200 型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)，AL204 電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)，AS10200AD 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，OSB—2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，SHZ—D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng))，HY—2 振蕩器，HH—4 電子恒溫水浴鍋，pHs—3 酸度計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮粗提物的制備

稱(chēng)取300.00 g 無(wú)柄金絲桃莖粉于燒杯中，在乙醇濃度61%，料液比52∶1(mL/g)，超聲時(shí)間21 min的條件下提取，將提取液離心除雜、過(guò)濾，干燥，得到粗提物，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

參照文獻(xiàn)［12］，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在干燥箱內(nèi)于120℃條件下恒重1.5 h，然后精確稱(chēng)取其0.0100 g 用60%的乙醇溶液配制成50.00 mL 的溶液。精確吸取黃酮對(duì)照品蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于6 支10.00 mL 的比色管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇稀釋到5.00 mL 處，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.30 mL，混勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，混勻，放置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液4.00 mL，混勻，加入30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，10 min 后于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度(以第一瓶為空白溶液)，然后以蘆丁溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)和吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，分析得到回歸方程為:A=9.8393C +0.0021，R=0.9998，結(jié)果表明在10～50 μg/mL 之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可作為無(wú)柄金絲桃莖部提取物總黃酮含量的測(cè)定依據(jù)。

2.3 總黃酮含量的測(cè)定

取一定量總黃酮粗提物，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中:C—溶液中總黃酮的濃度(mg/mL);V—定容體積(mL);M—粗提物的質(zhì)量(mg);W—總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

2.4 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

取D101 樹(shù)脂、S8 樹(shù)脂、AB8 樹(shù)脂、ADS17 樹(shù)脂4 種樹(shù)脂各50 g，用蒸餾水浸泡24 h 后裝柱，分別用無(wú)水乙醇浸泡4 種樹(shù)脂待充分溶脹，用無(wú)水乙醇沖柱至加入適量蒸餾水無(wú)渾濁，隨后用蒸餾水洗盡無(wú)水乙醇，備用。

2.5 大孔吸附樹(shù)脂的選擇

2.5.1 樹(shù)脂吸附率和解吸率的測(cè)定

稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理D101 樹(shù)脂、S8 樹(shù)脂、AB8 樹(shù)脂、ADS17 樹(shù)脂4 種干樹(shù)脂［13］各1.00 g，分別置于100 mL 具塞錐形瓶中，各加入一定量已知濃度的無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮溶液，振搖吸附24 h 后，過(guò)濾，測(cè)定平衡濃度，計(jì)算靜態(tài)吸附率;將上述飽和吸附的樹(shù)脂濾出，吸干表面水分，加入無(wú)水乙醇20 mL，振搖解吸24 h 后，過(guò)濾，測(cè)定平衡濃度，計(jì)算靜態(tài)解吸率。計(jì)算公式如下:

式中:Q1—吸附量;Q2—解吸量;A—吸附率(%);R—解吸率(%);C0—起始濃度(mg/mL);C1—平衡濃度(mg/mL);V1—吸附液體積(mL);M2—樹(shù)脂重量(g);C2—解吸液濃度(mg/mL);V2—解吸液體積(mL)。

2.5.2 靜態(tài)吸附解吸動(dòng)力學(xué)研究

取預(yù)處理的D101、AB8 兩種樹(shù)脂各1.00 g，置于2 個(gè)具塞三角瓶中，加入相同量的總黃酮粗提取物溶液，25 ℃下恒溫振蕩。按間隔時(shí)間1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算吸附量和解吸率，并繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)和解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

2.6 AB8 樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的工藝參數(shù)研究

分別考察上樣溶液的pH 值、上樣液濃度、上樣液流速、上樣液體積、樹(shù)脂柱徑高比、洗脫劑乙醇濃度、洗脫劑乙醇pH 值對(duì)樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮效果的影響。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝參數(shù)的條件下，取無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮粗提液進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)純化，并與未經(jīng)AB8 大孔吸附樹(shù)脂純化的總黃酮粗提液3 組平行試驗(yàn)進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔吸附樹(shù)脂的選擇

3.1.1 樹(shù)脂吸附率和解吸率的測(cè)定

表1 不同型號(hào)樹(shù)脂物理性能及對(duì)總黃酮的吸附和解吸情況Table 1 Adsorption and desorption conditions of flavonoids and physical properties of different types of resins

圖1 D101、AB8 樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(A)和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(B)(25 ℃)Fig.1 Static adsorption kinetic curves (A)and static desorption kinetic curves (B)of D101 and AB8 at 25 ℃

圖2 上樣液pH 值(A)、上樣液濃度(B)、上樣液流速(C)和徑高比(D)對(duì)AB8 樹(shù)脂吸附率的影響Fig.2 Effects of pH (A)，concentration (B)，flow rate of sample solution (C)and diameter/height ratio of resin column (D)on adsorption rate of AB8

不同類(lèi)型的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的吸附率和解吸率如表1，S8 的吸附率最大，但是解吸率卻很小;ADS17 的吸附率最小，且解吸率小于D101、AB8 樹(shù)脂，可排除。D101、AB8 兩種樹(shù)脂的吸附率和解吸率相當(dāng)，需通過(guò)吸附解析動(dòng)力學(xué)研究，對(duì)D101、AB8 樹(shù)脂做進(jìn)一步篩選。

3.1.2 靜態(tài)吸附解吸動(dòng)力學(xué)研究

由圖1(A)可知，在25 ℃下，在吸附初期，D101、AB8 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的吸附率隨時(shí)間的增加迅速增大，這是由于樹(shù)脂提供的活性吸附位點(diǎn)多、總黃酮的濃度高和克服傳質(zhì)阻力的推動(dòng)力大的原因［14］。當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到13 h后，吸附量增加已不明顯，但AB8 樹(shù)脂的吸附量比D101 大。由圖1(B)知，D101、AB8 樹(shù)脂都能在短時(shí)間內(nèi)解吸出無(wú)柄金絲桃莖中的黃酮類(lèi)化合物，相比之下，AB8 樹(shù)脂的解吸率稍高，D101 樹(shù)脂次之，這與樹(shù)脂的極性與無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮化合物的結(jié)構(gòu)相關(guān)，遵從結(jié)構(gòu)相似吸附原則。故本實(shí)驗(yàn)選擇AB8 樹(shù)脂為純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的樹(shù)脂。

3.2 AB8 樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的工藝參數(shù)研究

3.2.1 上樣液pH 值的選擇

在上樣溶液的pH 值分別為3、4、5、6、7、8 的條件下，經(jīng)預(yù)處理的1.00 g AB8 樹(shù)脂進(jìn)行吸附，10 h后測(cè)平衡液濃度，計(jì)算不同pH 值的吸附率，如圖2(A)所示，pH 值對(duì)AB8 樹(shù)脂的吸附影響顯著，主要是不同的pH 值的溶液有不同的電離程度，表現(xiàn)出對(duì)吸附物質(zhì)不同的親和力［14］，當(dāng)pH 值小于4.0 時(shí)，AB8 樹(shù)脂對(duì)總黃酮類(lèi)的吸附效果優(yōu)于堿性條件，故選擇上樣液pH=4.0 左右為佳。

3.2.2 上樣液濃度的選擇

取不同濃度的樣品溶液(pH=4.0)，以流速為1.00 mL/min 分別過(guò)AB8 大孔吸附樹(shù)脂柱、(10 mm×100 mm)，收集流出液，測(cè)定流出液中殘余總黃酮的量，計(jì)算不同上樣液濃度的吸附率，上樣濃度對(duì)AB8 大孔吸附樹(shù)脂的吸附率如圖2(B)所示。由圖2(B)知，在低濃度范圍內(nèi)(0.2～1.3 mg/mL)，上樣液濃度與吸附率呈正相關(guān)。隨著上樣液濃度增加，AB8 樹(shù)脂對(duì)無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的吸附率增加;而在1.30 mg/mL 后，吸附率呈下降趨勢(shì)，這是由于大孔吸附樹(shù)脂具有一定的吸附容量，當(dāng)吸附量達(dá)到飽和時(shí)，其對(duì)黃酮類(lèi)化合物的吸附減弱，即泄漏流出，故上樣液濃度應(yīng)選擇在1.30 mg/mL 左右為宜。

3.2.3 上樣液流速的選擇

取濃度為1.30 mg/mL 的總黃酮提取液(pH=4.0)，分別在流速為0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL/min 下過(guò)柱(10 mm ×100 mm)，收集流出液，測(cè)定流出液中殘余總黃酮的量，計(jì)算不同上樣液流速的吸附率，如圖2(C)所示，樹(shù)脂的吸附容量隨流速的增大而下降。因此，在相同條件下，上樣液流速慢有利于無(wú)柄金絲桃莖中黃酮類(lèi)化合物的吸附，但考慮到工作效率，選擇1.00 mL/min 的流速過(guò)柱。

圖3 上樣液體積對(duì)AB8 樹(shù)脂未吸附率的影響Fig.3 Effect of sample volume on end of adsorption of AB8

3.2.4 上樣液體積的選擇

取濃度為1.30 mg/mL 的樣液(pH=4.0)，以1.00 mL/min 速度過(guò)柱(10 mm × 100 mm)，以5 mL/瓶收集流出液，測(cè)定泄漏點(diǎn)(以未吸附率達(dá)到25%計(jì))，考察不同上樣體積對(duì)未吸附率的影響，如圖3 所示。由圖3 可知，上樣液體積在5～60 mL 時(shí)未吸附率呈緩慢上升，說(shuō)明此階段為吸附過(guò)程;而到60 mL 后未吸附率開(kāi)始急劇上升，這說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)達(dá)到泄漏點(diǎn)，而在120 mL 之后未吸附率基本不再變化，說(shuō)明樹(shù)脂的吸附容量在此條件下已達(dá)到飽和點(diǎn)。因此，為避免樹(shù)脂吸附過(guò)飽和而成死吸附，上樣液體積應(yīng)選擇在60 mL 左右為宜。

3.2.5 樹(shù)脂柱徑高比的選擇

取濃度為1.30 mg/mL 的樣液60 mL(pH=4.0)，分別在樹(shù)脂柱徑高比為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1∶20，流速為1.00 mL/min 的條件下過(guò)柱，測(cè)定流出液中總黃酮含量，考察不同徑高比對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響，如圖2(D)所示。由圖2(D)可知，在其它條件恒定下，當(dāng)樹(shù)脂柱徑高比為1∶10 時(shí)，吸附率最大，故選擇1∶10 的樹(shù)脂柱徑高比。

3.2.6 洗脫劑濃度的選擇

由于乙醇具有極性大、毒性低及易濃縮回收的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為洗脫劑。取濃度為1.30 mg/mL、體積60 mL(pH=4.0)的樣液，以1.00 mL/min 速度分別過(guò)5 根AB8 樹(shù)脂柱(10 mm × 100 mm)，待吸附平衡后，先以蒸餾水洗脫，再分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇以1 mL/min 流速進(jìn)行洗脫，以三角燒瓶收集流出液(5 mL/瓶)，測(cè)定總黃酮含量，并計(jì)算不同乙醇濃度的洗脫率與洗脫量。由圖4(A)可以看出，隨著洗脫劑中乙醇濃度的增加，無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的洗脫率也增加，當(dāng)70%乙醇洗脫時(shí)，洗脫率最高，達(dá)到96.8%，由圖4(B)可知，當(dāng)用70%乙醇洗脫，脫附峰比較集中，且洗脫劑用量也相對(duì)較小，故選擇70%乙醇溶液為最佳洗脫劑。

圖4 乙醇濃度對(duì)洗脫率的影響(A)和動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)(B)Fig.4 Effects of ethanol concentration on elution rate of flavonoids (A)and dynamic elution curve (B)

圖5 洗脫劑pH 值對(duì)洗脫率的影響Fig.5 Effect of eluent pH on elution rate of flavonoids

3.2.7 洗脫劑pH 值的選擇

在其它條件不變的情況下，考察不同pH 值乙醇洗脫劑對(duì)總黃酮洗脫率的影響，其洗脫效果如圖5 所示。由圖5 可知，當(dāng)洗脫劑pH 值為8.0 左右時(shí)，洗脫率最大，這是因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物顯弱酸性，因此稍顯堿性的洗脫劑，有助于洗脫率的增大。考慮到實(shí)驗(yàn)操作的方便性，乙醇溶液顯中性，且pH 值為7.0 與8.0 的洗脫率較接近，本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫劑pH 值為7.0。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝參數(shù)的條件下，取無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮粗提液進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)純化，并與未經(jīng)AB8 大孔吸附樹(shù)脂純化的總黃酮粗提液3 組平行試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，未經(jīng)AB8 大孔吸附樹(shù)脂吸附純化時(shí)，無(wú)柄金絲桃莖部提取物總黃酮的平均含量為30.26%，經(jīng)AB8 吸附樹(shù)脂純化的總黃酮平均含量為55.70%，純度提高84.07%。表明AB8 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)無(wú)柄金絲桃莖部提取物總黃酮起到了有效的純化效果。

表2 AB8 樹(shù)脂純化前后總黃酮的含量比較Table 2 Comparison of flavonoids content before and after purification by AB8

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選取D101、AB8、S8、ADSL17 4 種不同極性的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的純化效果進(jìn)行比較分析，通過(guò)靜態(tài)吸附、解析動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，得到弱極性大孔吸附樹(shù)脂AB8 易吸附(吸附率為68.35%)，易解吸(解吸率為93.18%)，是性能良好的純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的最佳樹(shù)脂。同時(shí)，優(yōu)化了AB8 大孔吸附樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮的工藝條件，得到最佳純化工藝參數(shù)為上樣液濃度為1.30 mg/mL、體積為60 mL、pH=4.0，1.00 mL/min 的流速，樹(shù)脂柱徑高比為1∶10，pH=7.0 的70%乙醇洗脫劑。在最佳工藝參數(shù)的條件下，無(wú)柄金絲桃莖部提取物總黃酮的純度由30.26%提高到了55.70%，純度提高84.07%，說(shuō)明用AB8 大孔吸附樹(shù)脂純化無(wú)柄金絲桃莖部總黃酮方法具有一定的推廣價(jià)值。

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