多殺菌素分離純化工藝的研究

夏燕春 王 超 吳江磊 鄒球龍 李 春 張曉琳

多殺菌素分離純化工藝的研究

夏燕春1，2王 超2吳江磊3鄒球龍2李 春1張曉琳2

（石河子大學化學化工學院新疆兵團化工綠色過程重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地1，石河子 832003）
（國家糧食局科學研究院2，北京 100037）
（武漢輕工大學生物與制藥工程學院3，武漢 430023）

利用大孔樹脂吸附結(jié)合硅膠柱層析技術(shù)對發(fā)酵液中多殺菌素的分離純化進行了研究。首先考察了提取溶劑、發(fā)酵液pH和料液比對浸提多殺菌素的影響；然后對7種不同極性的大孔吸附樹脂進行了靜態(tài)和動態(tài)吸附性能的研究，考察了不同吸附、解吸條件對大孔吸附樹脂性能的影響，最后對硅膠柱層析法精制多殺菌素的工藝條件進行了探索。結(jié)果表明：當發(fā)酵液pH為8.0，料液比1∶3（g∶v）時，乙醇可高效浸提多殺菌素；大孔吸附樹脂DM11對多殺菌素的靜態(tài)吸附量和解吸率分別為12 508μg／g（濕樹脂）和93.47%；大孔樹脂動態(tài)吸附最佳pH為9.0，最佳載樣比為多殺菌素質(zhì)量（mg）：樹脂體積（mL）＝2.5∶1；采用70%～95%乙醇梯度洗脫，多殺菌素洗脫率為97.5%；多殺菌素精制時硅膠柱以石油醚／乙酸乙酯／甲醇（2∶1∶0.2和1∶1∶0.25）為洗脫劑進行分段洗脫。該工藝得到的多殺菌素回收率為67.25%，純度為90.58%。

多殺菌素 大孔吸附樹脂 硅膠層析 分離 純化

多殺菌素（spinosad）是一種新型的綠色廣譜大環(huán)內(nèi)酯類生物殺蟲劑，其主要活性成份為spinosyn A（約占 85% ～90%）和 spinosyn D（約占 10% ～15%）［1-2］。它是由美國禮來公司篩選得到的放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物［3-4］。因其獨特的殺蟲機理，能有效防治多種儲糧害蟲，用藥量極少、持效期長、殘留低、無交互抗性，對哺乳動物、魚類、鳥類和大多數(shù)益蟲具有極高的安全界限等優(yōu)點，3次獲得美國“總統(tǒng)綠色化學品挑戰(zhàn)獎”（Presidential Green Chemistry Challenge Award）［5-7］。1997年第一次注冊登記用于多種作物（棉花、果蔬、煙草和中藥等），2002年被有機原料評估協(xié)會（Organic Materials Review institute）允許用于有機食品生產(chǎn)中，2005年被美國環(huán)保局批準用作儲糧防護劑，2007年被歐盟批準用于有機物上［8-9］。

圖1 多殺菌素A和D的結(jié)構(gòu)式

多殺菌素難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈等有機溶劑，因此，常用的提取方法有溶媒萃取法、吸附色譜法和離子交換法［10-12］。溶媒萃取法較其他方法分離速度快，收率高，且產(chǎn)品質(zhì)量有保證，但是此法需消耗大量有機試劑。如果產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，則需要高速離心設備，造成分離純化過程復雜，并降低了產(chǎn)品收率。此外，有機試劑還會帶來嚴重污染，并且通過萃取方法很難得到高純度產(chǎn)品。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且具有大孔結(jié)構(gòu)的有機高聚物吸附劑［11，13］。采用大孔吸附樹脂法提取多殺菌素可節(jié)約大量有機溶劑，操作簡便安全，樹脂可以再生，反復利用可以降低生產(chǎn)成本［14］。

國內(nèi)關(guān)于多殺菌素的制備工藝尚未形成高效、高得率的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，因此從成分復雜的發(fā)酵液中分離純化多殺菌素，建立多殺菌素高效、實用的分離純化技術(shù)就顯得尤為重要。為此，本研究根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和多殺菌素的濃度，選擇合適的溶劑進行提取，然后利用大孔吸附樹脂進行分離純化，最后通過硅膠柱層析進行精制，獲得目標純度的多殺菌素，旨在為多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

多殺菌素標準品（98%）：Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：Merck公司；硅膠（200～300目）：青島海洋化工有限公司；玻璃層析柱（2 cm×23 cm，4 cm×50 cm和10 cm×100 cm）：北京瑞澤康生物科技有限公司。

高效液相色譜儀（515Pump，717plusAutosampler，2487Detector）：美國 Waters公司；Delta320型 pH計：瑞士MettlerToledo公司；Eppendorf AG22331Hamburg型離心機：德國Eppendorf公司；LABOROTA 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司。

1.2 吸附劑

本試驗選擇大孔吸附樹脂包括DM系列樹脂：山東魯抗立科藥物化學有限公司；Hp20、SP70、SP825和SP207型號樹脂：日本三菱化學公司；XAD-16樹脂：美國羅姆-哈斯公司，其理化性質(zhì)如表1所示。樹脂預處理在玻璃層析柱上進行：樹脂裝柱→乙醇（95%）浸泡過夜→大量水洗凈乙醇→3 BV（1倍柱體積記為1 BV）的3～5%鹽酸沖洗柱床→去離子水沖洗至pH接近中性→3 BV的4～6%的NaOH沖洗柱床→去離子水沖洗至pH接近中性即可使用。

表1 大孔吸附樹脂的物理和化學性質(zhì)

1.3 多殺菌素浸提液制備

利用課題組前期通過物理化學誘變和分子生物學改造獲得的多殺菌素高產(chǎn)刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa ASAGF73，由國家糧食局科學研究院保藏）進行發(fā)酵罐液體發(fā)酵，獲得高濃度多殺菌素發(fā)酵液（≥2 g／L）。發(fā)酵液 4 000 r／min，離心 15 min，收集菌絲體，調(diào)節(jié)pH，加入3倍體積的乙醇浸提24 h。于4 000 r／min離心 15 min，取上清液，HPLC檢測濃度后經(jīng)真空濃縮至原始體積的1／10，即得多殺菌素提取液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大孔吸附樹脂的選型

分別稱取2.0 g預處理樹脂于250 mL具塞磨口三角瓶中，按樹脂／提取液1∶60（g／v）的比例加入多殺菌素提取液，置于29℃、160 r／min搖床上振蕩吸附6 h。取經(jīng)吸附后的殘液，14 000 r／min離心10 min，上清液通過HPLC檢測多殺菌素濃度，計算樹脂的吸附量和吸附率，重復3次。

式中：Q為吸附量／μg／g；EA為吸附率／%；W為樹脂質(zhì)量／g；C0為浸提液初始質(zhì)量濃度／μg／mL；Ce為吸附后殘夜?jié)舛龋蘥／mL；Vi為吸附液體積／mL。

當吸附達到平衡時，將樹脂過濾，去離子水洗滌，加入50 mL乙醇于29℃，160 r／min搖床解吸附6 h。HPLC分析殘液中多殺菌素的濃度，計算樹脂的解吸量和解吸率，重復3次。

式中：Ed解吸率／%；Cd解吸液質(zhì)量濃度／μg／mL；Vd解吸液體積／mL。

1.5 大孔吸附樹脂上樣量確定

分別量取12份300 mL經(jīng)預處理過的多殺菌素發(fā)酵提取液，旋蒸后分別上樣于相同規(guī)格填裝有不同體積大孔樹脂（2.5～50 mL）的層析柱中，用3 BV水洗，分段收集流出液，每10 mL收集1次，收集10份共100 mL的上樣液，依次編號，用HPLC分析洗脫液中多殺菌素的濃度。以大孔樹脂體積為橫坐標、多殺菌素濃度為縱坐標繪制過載曲線。

1.6 pH對大孔樹脂吸附性能的影響

250 mL具塞磨口三角瓶中加入100 mL多殺菌素浸提液，用1 mol／L NaOH或 HCl分別調(diào)為不同pH（5～11），每組3個平行，按大孔樹脂與提取液1∶60的比例加入2 mL預處理過的樹脂，置于29℃、160 r／min搖床上振蕩吸附6 h，取上清液，14 000 r／min離心15 min，HPLC分析多殺菌素濃度，計算不同pH條件下對大孔樹脂吸附性能的影響。

1.7 動態(tài)吸附洗脫試驗

將預處理好的樹脂濕法裝入玻璃層析柱中（2.0 cm×23 cm），先將多殺菌素濃縮液上柱，待樹脂吸附多殺菌素后用去離子水洗至流出液無色，再用不同濃度的乙醇梯度洗脫，按一定體積收集洗脫液。通過TLC跟蹤檢測多殺菌素，考察各種因素對大孔樹脂吸附性能的影響，確定大孔樹脂最大吸附量及最佳的洗脫劑濃度。

由圖2可知，丙酮為提取溶劑時效率較高，多殺菌素濃度為1 247.83μg／mL，相比于甲醇（1 145.71 μg／mL）和乙醇（1 193.37μg／mL）提取率并無顯著差異（P＞0.05），但丙酮有害性高于甲醇及乙醇。綜合考慮提取效率及試劑的安全性，本試驗中采用乙醇作為浸提溶劑。

以乙醇為浸提溶劑，考察了不同量的菌絲體與提取溶劑比例對多殺菌素提取效率的影響，結(jié)果如下圖3所示。

1.8 硅膠層析法精制多殺菌素

硅膠的活化→樣品的準備→裝柱（采用干法裝柱）→加樣→洗脫（采用不同比例的石油醚／乙酸乙酯／甲醇（4∶1∶0.1、3∶1∶0.1、2∶1∶0.1、2∶1∶0.2、2∶1∶0、1∶1∶0.25和 1∶2∶0.5）進行梯度洗脫），TLC跟蹤檢測，根據(jù)洗脫液中多殺菌素含量考察各種洗脫液對硅膠精制的影響，確定最佳的洗脫劑比例。

1.9 多殺菌素的HPLC檢測

取一定體積的提取液，加入甲醇稀釋后，14 000 r／min離心10 min，上清液進行HPLC分析，檢測條件為：C18反相柱（ZORBAX Ecllipe XDB-C18，4.6 mm×100 mm，3.5μm）；流動相為乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，含 0.05%乙酸銨；進樣量為 10μL；流速為1.0 mL／min；檢測波長為244 nm。根據(jù)多殺菌素A和D組分的積分面積，參照標準品計算其質(zhì)量濃度，兩組分之和為多殺菌素含量［15］。

1.1 0 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件進行整理統(tǒng)計和分析。文中圖形采用Origin 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對多殺菌素浸提效率的影響

考察不同提取溶劑（甲醇、乙醇、丙酮和乙腈）對多殺菌素提取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溶劑對多殺菌素提取效率的影響

圖3 不同料液比對多殺菌素提取效率的影響

由圖3可知，多殺菌素的提取效率隨提取料液比的增大而增大，這是由于料液比越高，細胞內(nèi)外濃度差越大，從而傳質(zhì)推動力大，擴散速度也越大，因此有利于多殺菌素的溶出。當料液比為1∶3時，多殺菌素的提取濃度達到最高為1 322.88μg／mL，此時細胞內(nèi)外多殺菌素已達到溶解平衡。因此本試驗選用提取試劑體積為菌絲體質(zhì)量3倍作為最佳的提取料液比。

此外，由多殺菌素的理化性質(zhì)可知，多殺菌素在pH 5～13范圍內(nèi)較穩(wěn)定［16］，因此本試驗選擇在pH 6.0～11.0范圍內(nèi)測定乙醇對多殺菌素的提取效率，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對多殺菌素提取效率的影響

由圖4可知，在中性偏堿性環(huán)境下，多殺菌素的提取率較好。當發(fā)酵液pH為8.0時，多殺菌素的提取率最高。這可能是由于在堿性條件下，部分蛋白被沉淀，使提取試劑與細胞之間接觸更充分，傳質(zhì)阻力減小，從而加速了多殺菌素的溶出。因此，確定最佳的提取pH值為8.0。

2.2 大孔吸附樹脂分離純化多殺菌素

2.2.1 大孔吸附樹脂的選型

樹脂吸附量的大小是吸附分離提取法的關(guān)鍵，因此需根據(jù)被分離物的特性、樹脂的極性（功能基）及其空間結(jié)構(gòu)（孔徑、比表面、孔容）選擇樹脂進行分離純化［17］。本試驗選取了DM系列樹脂、Hp20、XAD16等7種不同極性大孔樹脂進行靜態(tài)吸附和解吸附試驗，比較不同大孔樹脂對多殺菌素吸附量、解吸量和解吸率的大小，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同樹脂吸附性能的比較

從圖5可以得出XAD-16、DM68和DM11 3種樹脂對多殺菌素的飽和吸附量較大，分別為：13 421、14 332和 12 508μg／g（樹脂）。但 XAD-16和DM68的解吸率（分別為89.37%和87.42%）相對于DM11（93.47%）較低。綜合考慮大孔樹脂的吸附和解吸附性能，選取DM11用于多殺菌素的分離純化。

2.2.2 pH對大孔吸附性能的影響

pH值是影響大孔樹脂吸附能力的一個關(guān)鍵參數(shù)，它影響溶質(zhì)電離的程度，導致溶質(zhì)和溶液之間親和力的改變［18］。多殺菌素為弱堿性化合物，根據(jù)酸性物質(zhì)在酸性介質(zhì)中有利于吸附，堿性物質(zhì)在堿性介質(zhì)中有利于吸附的規(guī)律，在堿性條件下大孔樹脂吸附對多殺菌素的吸附效果更佳。因此，本試驗考察了在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)大孔樹脂對多殺菌素的靜態(tài)吸附特性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH對大孔樹脂吸附性能的影響

由圖6可知，隨著pH的升高，大孔樹脂對多殺菌素的吸附量顯著增高，當pH大于9.0時，吸附量趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，大孔樹脂在堿性范圍內(nèi)有利于多殺菌素的吸附。但隨著堿性增強，發(fā)酵液或提取液中會產(chǎn)生大量的絮狀沉淀。因此，確定最佳的大孔樹脂吸附pH為9.0。

2.2.3 大孔樹脂動態(tài)吸附試驗

當大孔樹脂吸附量達到飽和時對多殺菌素的吸附能力減弱甚至消失，此時多殺菌素開始泄露流出。本研究考察大孔樹脂DM11的動態(tài)吸附性能，結(jié)果如圖7所示。

圖7 DM11大孔樹脂載樣量確定

由圖7可知，隨著大孔樹脂體積的增大，樹脂的吸附量也不斷增加，當大孔樹脂體積為40 mL時，對多殺菌菌素的吸附量趨向飽和，為98.67 mg，隨后大孔樹脂的吸附量不再隨樹脂體積的增大而增加，即達到吸附平衡。故大孔樹脂的最佳載樣比為多殺菌素質(zhì)量（mg）∶樹脂體積（mL）＝2.5∶1。

2.2.4 乙醇濃度對多殺菌素解吸附性能的影響

將DM11型樹脂濕法裝柱，待樹脂吸附飽和后先用2 BV去離子水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再以10%～95%乙醇為洗脫劑進行梯度洗脫，按BV收集，合并各收集的組分，HPLC檢測洗脫液中多殺菌素濃度，結(jié)果如圖8所示。

圖8 乙醇對多殺菌素解吸性能的影響

由圖8可知，乙醇體積分數(shù)為10%～50%洗脫液呈深黃色，未檢測到多殺菌素。當乙醇體積分數(shù)為70%時，多殺菌素被大量洗脫，直至95%乙醇洗脫后幾乎檢測不到多殺菌素。因此，收集乙醇體積分數(shù)為70%～95%范圍內(nèi)的洗脫液進行真空濃縮和冷凍干燥。

3 硅膠柱層析法精制多殺菌素

干法裝柱后，先用1 BV的石油醚打通硅膠柱，然后依次用不同比例的石油醚／乙酸乙酯／甲醇進行梯度洗脫。當石油醚／乙酸乙酯／甲醇比例為2∶1∶0.2時，多殺菌素被大量洗脫，洗脫液呈淺黃色，當石油醚／乙酸乙酯／甲醇洗脫至1∶2∶0.5時，TLC結(jié)果顯示，大量雜質(zhì)一同被洗脫下來，收集并濃縮石油醚／乙酸乙酯／甲醇2∶1∶0.2至 1∶1∶0.25段洗脫流分，真空濃縮和冷凍干燥流分得到多殺菌素純品。稱取一定量分離純化后的多殺菌素，經(jīng)甲醇充分溶解后，HPLC檢測其純度并計算回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 DM11型樹脂與硅膠柱層析分離純化多殺菌素試驗結(jié)果

4 討論

大孔樹脂吸附的實質(zhì)為一種物質(zhì)高度分散或表面分子受作用力不均等而引起的表面吸附現(xiàn)象，利用分子間的范德華力、氫鍵作用和大孔樹脂的多孔結(jié)構(gòu)對分子大小不同的物質(zhì)進行篩選分離。本研究根據(jù)被分離物質(zhì)的特性選取了DM系列樹脂、Hp20、XAD16等7種不同極性大孔樹脂進行靜態(tài)吸附和解吸附試驗，最終確定了DM11弱極性樹脂。該樹脂既能夠從非水介質(zhì)中吸附極性物質(zhì)，又能從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)［19］。胡西洲等［20］、王琨等［21］的研究結(jié)果也證明了弱極性樹脂有利于多殺菌素的吸附。另外本研究發(fā)現(xiàn)，非極性樹脂DM68對多殺菌素的吸附量最大，但其解吸率較低，分析原因可能是DM68的比表面積較大，因此其吸附量也較高，但其孔徑相對較小，與多殺菌素的結(jié)合能力較強，不利于多殺菌素的解吸附。而DM11樹脂具有適當?shù)谋缺砻娣e和孔徑，其吸附和解吸附率都較為理想。

本研究還發(fā)現(xiàn)pH對多殺菌素的提取效率以及大孔樹脂的吸附性能均有較大影響。夏立秋等［22］在進行刺糖多孢菌發(fā)酵液中多殺菌素分離純化工藝研究時，為提高多殺菌素的提取效率，將浸提液的pH調(diào)為8.5～11.5。秦為輝等［23］研究發(fā)現(xiàn)pH為10.0時，多殺菌素提取效果較好。王琨等［21］的研究結(jié)果表明，當pH大于9.0時，DM11樹脂對多殺菌素的吸附率穩(wěn)定在90%以上。胡西洲等［20］考察樹脂吸附的泄漏率時發(fā)現(xiàn)，pH為11.0時大孔樹脂對多殺菌素的泄漏率最低。以上研究結(jié)果表明，在堿性條件下（pH為9.0～11.0），有利于大孔樹脂對多殺菌素的吸附。

本研究通過DM11大孔樹脂對多殺菌素發(fā)酵液進行分離純化后，多殺菌素的純度僅為70%。為了提高多殺菌素的純度，采用硅膠柱層析進行了進一步的精制研究。硅膠柱層析分離洗脫過程實質(zhì)上是流動相分子與被分離的溶質(zhì)競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程。強極性的組分應選用極性強的流動相洗脫，相反，對弱極性的組分則應選用弱極性的流動相進行洗脫［24］。由于多殺菌素為弱極性化合物，本研究選用了石油醚／乙酸乙酯／甲醇為洗脫液進行梯度洗脫，最終得到了純度為90%以上的多殺菌素。

5 結(jié)論

本文利用大孔樹脂吸附結(jié)合硅膠柱層析技術(shù)對發(fā)酵液中多殺菌素的分離純化工藝進行了研究。結(jié)果表明：當發(fā)酵液pH為8.0，料液比為1∶3時，乙醇可高效浸提多殺菌素；大孔樹脂DM11對多殺菌素的靜態(tài)吸附量和解吸附率分別為12 508μg／g（濕樹脂）和93.47%；大孔樹脂動態(tài)吸附最佳pH為9.0，最佳載樣比為多殺菌素質(zhì)量（mg）∶樹脂體積（mL）＝2.5∶1；采用70%～95%乙醇梯度洗脫，多殺菌素洗脫率為97.5%；多殺菌素精制時硅膠柱以石油醚／乙酸乙酯／甲醇（2∶1∶0.2和 1∶1∶0.25）為洗脫劑進行分段洗脫，該工藝得到的多殺菌素純度為90.58%，回收率為67.25%。

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Extraction and Purification of Spinosad

Xia Yanchun1Wang Chao2Wu Jianglei3Zou Qiulong2Li Chun1Zhang Xiaolin2
（School of Chemistry and Chemical Engineering Key Laboratory for Green Process of Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan Shihezi University1，Shihezi 832003）
（Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037）
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering3Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023）

Extraction and purification of spinosad from fermentation broth has been studied by macroporous resin adsorption supported with silica gel chromatography technology.First，the influences of the type of extraction solvents，extraction solvents volume and pH in spinosad extraction process were investigated.Second，the static and dynamic adsorption expressions of seven varieties of macroporous resins for spinosad extraction were studied and the op-timum macroporous resin was selected in present process.Finally，the silica gel chromatography technology was explored for spinosad purification.The results showed that ethanol had ability to extract the spinosad efficiently on the condition of the pH of fermentation broth 8.0，the ratio of material and solvent was 1∶3（g／v）.DM11 was selected as the optimum macroporous resin to extract and separate spinosad on the experimental condition；the adsorption and desorption ratio of DM11 macroporous resin for spinosad was 12 508μg／g（wet resin）and 93.47%respectively.The maximum adsorption capacity of DM11 macroporous resin for spinosad could be reached at pH 9.0.The optimal ratio of spinosad and macroporous resin for adsorption was 2.5∶1（mg∶mL）.When 70% ～95%ethanol was utilized as eluant，the desorption capacity reached 97.5%.The silica gel column chromatography was adopted for further purification of spinosad by gradient elution using a mixture of petroleum ether：ethyl acetate：methanol（2∶1∶0.2 and 1∶1∶0.25），and the highest purity of 90.58%was obtained under these conditions.

spinosad，macroporous resin，silica gel column，separation，purification

S482.3+9

A

1003-0174（2014）03-0095-07

時間：2014-03-13 16：56

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20140313.1656.010.html

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAD03B02-2），2013年“農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目”（2013GB 24490638）

2013-08-24

夏燕春，女，1987年出生，碩士，生物化工通訊作者：李春，男，1970年出生，教授，生物化工

張曉琳，女，1975年出生，研究員，微生物學