米黑毛酶提高大豆分離蛋白泡沫穩定性的研究

陳 卓 侯俊杰 楊曉泉

米黑毛酶提高大豆分離蛋白泡沫穩定性的研究

陳 卓 侯俊杰 楊曉泉

（華南理工大學輕工與食品學院食物蛋白質工程研究中心，廣州 510640）

通過測定不同水解pH條件、不同水解時間、不同攪打起泡pH條件下大豆分離蛋白（SPI）的泡沫穩定性，結合SDS-PAGE分析，水解度分析及蛋白分子表面疏水性分析，為利用米黑毛酶水解大豆分離蛋白制備高泡沫穩定性大豆蛋白制品提供一定的理論依據。顯示結果表明：SPI經米黑毛酶在pH 3.5處水解45～60 min后，回調pH至5.0攪打起泡的泡沫穩定性最優；隨水解時間增長，SPI的泡沫穩定性有不同程度提高。通過酶解作用，伴隨SPI的蛋白分子量減小，蛋白分子表面疏水性增加，泡沫的穩定性顯著提高。

米黑毛酶 大豆分離蛋白 泡沫穩定性

大豆分離蛋白具有高營養價值和良好功能性質，在食品工業中的應用日趨廣泛。大豆分離蛋白分子包含疏水性基團和親水性基團，因而具有表面活性，能降低水的表面張力［1］，在劇烈攪拌時形成泡沫，常用作食品中的乳化劑和界面穩定劑。同時在攪打稀奶油、冰淇淋、巧克力等充氣食品中，蛋白質的泡沫性能對食品的結構起了重要的穩定作用［2］。

改善蛋白泡沫性能的3個關鍵因素是：減小蛋白分子量，增大蛋白分子表面疏水性以及改變蛋白分子的微結構［3］。相較于安全性不高的磷酸化法［4］，蛋白質的酶法水解可以在不降低營養價值的前提下改善其理化和功能性質，且反應高效、溫和、安全，是改善蛋白功能特性的更優手段。現有酶法水解技術雖然可以顯著提高大豆蛋白的起泡能力，但同時也會降低其泡沫穩定性［5-6］。一般來說，提高起泡特性既要提高其起泡能力又要提高其泡沫穩定性，而對于蛋白質來說，提高其泡沫穩定性更有意義。

米黑毛酶能迅速、專一地打開 k-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，作為凝乳酶廣泛應用于制作干酪［7］，但其在植物蛋白方面的應用報道較少。

在前人對米黑毛酶的高效凝乳作用機理的研究基礎上［8-9］，本研究試想利用米黑毛酶專一地打開SPI中某些化學鍵，使水解產物中親水性和疏水性側鏈基團的存在狀態及分布發生變化，從而提高泡沫穩定性。本試驗對不同水解pH條件、不同水解時間、不同攪打起泡pH條件下，SPI水解產物的泡沫穩定性進行了試驗分析，結合SDS-PAGE分析，水解度分析及蛋白分子表面疏水性分析，探討了利用米黑毛酶水解SPI制備高泡沫穩定性大豆蛋白制品的理論依據。本研究旨在開發一種高泡沫穩定性的大豆蛋白制品，實現更有目的性地對蛋白質進行改性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂大豆粕購于山東禹王有限公司，粉碎過80目篩后儲存于4℃下密閉容器中。豆粉蛋白質質量分數為（55.5±0.4）%，氮溶指數84.0%。所用化學試劑均為分析純。米黑毛酶（Marzyare 150MG）購于丹尼斯克有限公司。

UV2300紫外可見分光光度計、F-7000日立熒光光譜儀：日立（Hita chi）公司；pHs-3C數顯 pH計：上海雷磁儀器廠；APV-1000高壓均質機：丹麥APV公司；rapid N cube杜馬斯定氮儀：法國Elementar公司；Alp Ha-4冷凍干燥機：德國 MATRIN CHRIST公司；PYCZ-30垂直板電泳儀：北京六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法［10］制備大豆分離蛋白，杜馬斯定氮法測得蛋白質量分數為（90.80±0.26）%，SDS-PAGE檢測純度可達90%以上。

1.2.2 水解產物的制備

系列1：1 g／mL SPI溶液 50 mL，90℃水浴 30 min，冷卻到室溫，調 pH至3.5，加入0.2%米黑毛酶，于50℃水浴條件下反應，每隔15 min進行取樣。水浴過程中通過滴加 1 mol／L HCl（1 mol／LNaOH）保持反應pH于3.5。樣品85℃水浴15 min滅酶。

系列2：酶的底物調pH至7.0，水解反應保持pH于7.0，其他同系列1。

1.2.3 泡沫穩定性的測定

1 g／mL SPI溶液及不同酶水解的產物分別調pH至5.0和7.0，每份樣品于轉速12 000 r／min均質2 min。均質后快速傾倒至量筒，記錄泡沫體積及泡液混合物總體積，計算泡液比。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

根據Laemmli［11］的方法進行 SDS-PAGE分析，濃縮膠和分離膠質量濃度分別為5 g／mL和12 g／mL，考馬斯亮藍R-250染色。樣品濃度為0.2，上樣量為7μL。每條帶的相對分子質量使用 Sigmamarker（Mr 14 400～97 400）作為標準相對分子質量標定。

1.2.5 水解度的測定

根據Nielsen［12］的方法進行水解度測定。OPA試劑：將7.620 g硼砂和200 mgSDS溶于重蒸水，然后定容至150 mL，搖勻配制成A液；160 mgOPA溶于4 mL乙醇制成B液；將B液加入A液，混合均勻，再加入176 mg DTT，定溶至200 mL，避光保存。樣品為水解液40μL，稀釋10倍后加入3 mLOPA試劑，混合均勻，37℃水浴2 min，在波長340 nm處測定吸光值。標準溶液為400μL絲氨酸溶液（質量濃度0.1 mg／mL）加入3 mL OPA試劑。空白組為400μL去離子水加入3 mL OPA試劑。

式中：X為樣品中蛋白質含量，P為樣品中蛋白質量分數，α＝0.970，β＝0.342，htot＝7.8。

1.2.6 表面疏水性的測定（熒光探針ANS法）

表面疏水性是用1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）作為熒光探針進行測定［13］。將 1 g／mL SPI酶解液稀釋成0.2 mg／mL酶解液樣品。將濃度為 2.5 mmol／L的10μL ANS溶液分10次（每次1μL）加入8 mL樣品溶液。使用熒光光譜儀分別在390 nm（激發波長）和470 nm（發射波長）下測定熒光強度。電壓600 mV。每個樣品平行測定5次。樣品的熒光強度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對熒光強度值F。已加入樣品中的ANS的濃度記作L0。并以1／F和1／L0作回歸曲線，計算表面疏水性指數（PSH）。

式中：Fmax為最大熒光強度，Kd為表面電離常數；

式中：X＝0.2 mg／mL。

1.2.7 數據的統計與分析

除特殊說明外，每個試驗均重復3次，每個測定均重復3次。結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 11.5軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）中的One-Way ANOVA對所有數據進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析；應用Pearson correlation test進行變量之間的相關性分析。P＜0.05表示顯著，P＜0.01表示極顯著。

2 結果與討論

2.1 米黑毛酶對SPI水解度及組成的影響

2.1.1 水解度的分析

由圖1結果可知，隨著酶解時間增加，SPI的水解程度不斷加深。在pH 3.5水解條件下米黑毛酶的水解效率較高，酶解60 min后水解程度最深，說明經米黑毛酶處理的SPI溶液，蛋白小分子數量增加較多，結合SDS-PAGE圖譜，也可得到此結論。

圖1 SPI經米黑毛酶在不同pH不同酶解時間處理后的水解度

2.1.2 SDS-PAGE電泳分析

由圖2可知，在電泳圖譜中，與原SPI樣品相比，米黑毛酶于pH 7.0水解的樣品中（圖2：1～4），條帶變化不明顯，說明米黑毛酶在中性環境下，較難降解SPI各亞基。米黑毛酶于pH 3.5水解的樣品中（圖2：5～8），各亞基降解消失的程度明顯，同時伴隨有新的條帶產生，酶解時間不同，SPI的蛋白小分子條帶都有不同程度的增加。

圖1 SPI經米黑毛酶在不同pH不同酶解時間處理后的SDS-PAGE電泳圖譜

2.1.3 表面疏水性的分析

由表1可知，與SPI溶液相比，經米黑毛酶處理的樣品的表面疏水性指數明顯提升。分析認為，這是由于在酶處理過程中，維持大豆蛋白結構的次級鍵斷開，埋藏于蛋白質分子內部的疏水基團暴露所致［14］，從而提高了其表面疏水性。然而不同酶解時間的酶解液相比較，表面疏水性變化較小，有待進一步研究。

表1 SPI經米黑毛酶不同酶解條件處理的表面疏水性

2.2 pH 7.0酶解條件下米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響

由圖3結果可知，在pH 7.0中性條件下，SPI經米黑毛酶酶解不同時間后，再調至pH 7.0攪打起泡，隨著時間的增加，泡沫穩定性急劇下降。由圖4可知，若將酶解液調至pH 5.0攪打起泡，不同酶解時間的產物泡沫穩定性變化不明顯，但都優于未經酶解的SPI溶液。總體分析認為，中性環境不利于米黑蛋白酶發揮活性。

圖3 pH 7.0處不同酶解時間米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響（在pH 7.0處攪打起泡）

圖4 pH 7.0處不同酶解時間米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響（在pH 5.0處攪打起泡）

2.3 pH 3.5酶解條件下米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響

由圖5、圖6結果可知，在pH 3.5酸性條件下，SPI經米黑毛酶酶解不同時間后，再調pH至7.0或5.0攪打起泡，隨著時間增加，泡沫的穩定性也依次增加。由圖5可知，SPI在pH 3.5處酶解45 min與酶解60 min的產物相比，泡液比沒有明顯變化，基本穩定在45%附近。由圖6可知，若將酶解產物再回調pH至5.0攪打起泡，產物的泡液比最高能保持在50%附近，泡沫穩定性得到很大提高。

圖5 pH 3.5處不同酶解時間米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響（在pH 7.0處攪打起泡）

圖6 pH 3.5處不同酶解時間米黑毛酶對SPI泡沫穩定性的影響（在pH 5.0處攪打起泡）

由圖3～圖6結果分析認為，米黑毛酶更適宜應用到酸性食品中，在中性食品中泡沫穩定性的改變并不顯著。同時，在接近SPI等電點的pH 5.0處攪打起泡，泡沫穩定性都優于pH 7.0處攪打起泡的泡沫穩定性。分析認為，溶液pH值接近等電點時，產生的凝聚物有利于提高泡沫穩定性，且此時的泡沫均勻黏稠，氣泡細密較小。綜合SDS-PAGE、水解度、表面疏水性三者結果，分析認為，通過米黑毛酶在酸性條件下對SPI的水解，可以在一定程度上降低蛋白分子量，增加蛋白分子表面疏水性，達到提高泡沫穩定性的目的，這與Duyer等［3］的研究結果基本一致。

3 結論

本研究嘗試利用米黑毛酶專一地打開SPI中某些化學鍵，使水解產物中親水性和疏水性側鏈基團的存在狀態及分布發生變化，從而提高泡沫穩定性。在保持大豆蛋白良好的起泡能力的前提下，顯著提高了泡沫穩定性，且效果持久明顯，實現了更加有目的性地對蛋白質進行改性，提高了大豆蛋白的功能特性，有助于拓寬其在食品工業中作為配料應用的范圍。

研究結果表明，SPI經米黑毛酶在pH 3.5處水解45～60 min后，回調pH至5.0攪打起泡的泡沫穩定性最優；隨水解時間增長，SPI的泡沫穩定性有不同程度提高；酶解液在pH 5.0處攪打起泡的泡沫穩定性優于在pH 7.0處攪打起泡。通過酶解作用，伴隨SPI的蛋白分子量減小，蛋白分子表面疏水性增加，泡沫的穩定性提高。

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The Enhancement Effects of Mucor Miehei on the Foam Stability Properties of Soybean Protein Isolate

Chen Zhuo Hou Junjie Yang Xiaoquan
（Research and Development Center of Food Proteins，College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640）

The foam stability properties of SPI were measured at different pH and different time in this study with the analysis on the SDS-PAGE，degree of hydrolysis and surface hydrophobicity，providing theoretical foundation for the SPI products with high foam stability prepared by Mucor miehei.The results showed that the sample with the best foam stability properties was hydrolysed by Mucor miehei at pH 3.5 for 45～60 min；then it turned pH to 5.0.With the increase of time，the foam stability properties of SPI were improved at different degree.Through enzymatic hydrolysis，the foam stability properties of SPI were enhanced substantially with the decrease of SPI protein molecule weights and the increase of surface hydrophobicity.

soybean protein isolates，Mucor miehei，foam stability

TS21

A

1003-0174（2014）03-0052-05

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD33B10-2，2012BAD34B04-2），國家自然科學基金（31130124）

2013-04-17

陳卓，女，1989年出生，碩士，植物蛋白加工與利用

楊曉泉，男，1965年出生，教授，博士生導師，植物蛋白加工與利用