Bacillus amyloliquefaciens C-1 胞外發酵產物對食源性致病菌抑菌活性的初步研究

周文杰，楊 建，張瑞娟，萬 茵，韓 蓓*

1西安交通大學醫學部公共衛生學院;2 陜西省營養與食品安全工程研究中心，西安 710061;3南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生長條件寬泛，在寬譜的pH 和溫度范圍內都能很好的生長，具有潛在的經濟價值［1］。目前的研究表明解淀粉芽孢桿菌具有廣譜的抑菌活性，包括細菌和真菌，其主要的抑菌成分是抑菌蛋白［2］，也有抑菌成分為肽脂類、聚酮化合物［3-5］等的報道，以往有的研究以蛋白酶處理的方法證明其抑菌成分的多肽性質，而蛋白酶處理不能使其抑菌活性完全喪失［6］，也有一些研究嘗試提取抑菌成分后鑒定其化學成分，但由于所用不同的分離株［2，7］，因此不能排除其它性質抑菌成分存在的可能。

本實驗室從即食水果果盤上分離出一株解淀粉芽孢桿菌，命名為C-1，其在發酵過程中能產生大量的胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，該菌現保存于中國典型培養物保藏中(編號M 2012177)。胞外多糖是細菌的次級代謝產物，由細菌分泌到胞外并溶解于環境的水中，由于其分子致密交聯的原因，可以在細菌周圍形成屏障阻礙細菌同環境的物質能量交換，從而保護細菌免受毒物、噬菌體、高滲透壓、高溫、pH 等惡劣環境的影響［8-10］，但同時也可能因此而阻礙其他細菌對于環境營養物質的攝取進而抑制細菌的生長繁殖，具體機制仍是目前國內外的一個研究熱點。研究發現胞外多糖還有很多的生物活性，比如抗氧化、抗輻射、降血糖、刺激免疫、抑制腫瘤細胞生長等［11-13］，因而胞外多糖在生物膜制造，醫藥保健品開發方面具有很大的潛力［14，15］。

食源性致病菌是導致微生物性食物中毒的一類病原菌，根據中國疾病預防控制中心《衛生部辦公廳關于2012年全國食物中毒事件情況的通報》的統計數據:微生物性食物中毒事件中毒人數最多，占總數的56.1%。與2011年相比，報告起數和中毒人數分別減少28.2%和27.0%，但死亡人數增加2 人;主要是由沙門氏菌(Salmonellaspp.)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、志賀氏菌(Shigellaspp.)、椰毒假單胞菌(Psedomonascocovenenans)等引起的細菌性食物中毒［16］。對食源性致病菌的控制是食品工業防腐方向的一個重點，針對食源性致病菌的高效生物防腐劑研究成為了當前的熱點之一。

本實驗基于解淀粉芽孢桿菌的抑菌活性和C-1高產量的胞外多糖的性質，初步推測其胞外多糖可能為其抑菌成分之一。通過生長曲線試驗驗證了C-1 發酵液對9 株高致病率的食源性致病菌的抑菌活性，同時發現其對蠟樣芽孢桿菌產黑色素具有明顯的抑制作用，之后提純其胞外多糖，并通過平板抑菌活性實驗，證明不具有顯著的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

本實驗以Bacillus amyloliquefaciensC-1(本實驗室自行分離保藏)為生產菌株。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereusMS10362R)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)為中國科學院武漢病毒研究所袁志明研究員惠贈;梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficileQB21)和金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusS251)為本實驗室自行分離保藏;福氏痢疾桿菌(ShigellaflexneriCDC1)和宋內痢疾桿菌(ShigellasonneiCDC2)來源于西安市疾控中心;大腸桿菌(E.coliATCC25922，本實驗室保存菌株)，這7 株細菌為抑菌試驗的檢測菌株。

液體培養基采用LB 培養基，配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L;固體平板采用LB固體培養基和厭氧培養基RCM(強化梭菌厭氧培養基，青島海博生物技術有限公司);LB 固體培養基配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L，瓊脂1.5%。除厭氧梭菌需在厭氧培養箱(Coy，Ann Arbor，MI，USA)內進行培養，其余細菌均無特殊要求，通氣培養。

1.2 試劑

考馬斯亮藍G250 染料、Whatman4057050、Tris、EDTA、濃硫酸，1.0 mol/L NaCl、95%乙醇、0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、Sevage 試劑:(氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V)等試劑均為分析純。

1.3 B.amyloliquefaciensC-1 發酵液提取

接種環取C-1 單菌落至3 mL LB 液體培養基，37 ℃、200 rpm 恒溫搖床中培養過夜;次日按1%量轉接至50 mL LB 培養基中，30 ℃、200 rpm 恒溫搖床中培養5 h，按1%量轉接至多份150 mL LB 培養基中，30 ℃、200 rpm 恒溫箱中培養96 h。4 ℃，10000 rpm 離心取上清液，分為兩份，一份4 ℃下留置作為全發酵液上清(測定該上清的EPS 濃度)，一份用于提取胞外多糖。

1.4 C-1 發酵液抑菌試驗

1.4.1 平板法抑菌試驗

在直徑約15 cm 平板傾倒固體培養基厚約6 mm，冷卻后均勻打孔5 個，孔徑6 mm，其中包含陽性對照孔一個(敏感抗生素)，陰性對照孔一個(等體積的LB 液體培養基)，實驗組孔3 個，分別加入100 μL C-1 全發酵上清液(其EPS 濃度為1.0 mg/mL)，抑菌活性以抑菌圈直徑表示。

1.4.2 生長曲線法抑菌試驗

通過上述實驗選擇1～2 株對上清液敏感的菌株進行實驗，分為高劑量組、低劑量組、對照組三組，均為培養基150 mL，根據預實驗結果，分別加入上清液4 mL、0.6 mL、0 mL 并用培養基補足使三者液體總量一致。最適宜溫度下(芽胞桿菌30 ℃，其余細菌為37 ℃)，200 rpm 下培養，每2～3 h 取樣用全自動多功能酶標儀(Tecan，Infinite 200)測量OD600，并繪制生長曲線圖，每個樣品做3 個重復。

1.5 C-1 胞外多糖提取

將1.4 中上清液按照1∶3 比例加入無水乙醇，4℃下過夜沉淀多糖，次日4 ℃離心收集多糖，并用Sevage 試劑充分出去雜蛋白，離心，取上層EPS 溶液。用滅菌去離子水透析60 h，然后用聚乙二醇將透析過的胞外多糖濃縮，其間每3 h 用苯酚-硫酸法測EPS 的濃度直到其濃度≥C-1 全發酵上清液內EPS 濃度為止。將收集到的EPS 溶液4 ℃下保存待用。

用考馬斯亮藍G250 處理標準蛋白溶液，得到蛋白質標準曲線，并最終得到粗胞外多糖中蛋白質含量定量測定結果。

1.6 C-1 胞外多糖抑菌試驗

平板及分組情況同1.4.1，差別僅為實驗組加入100 μL EPS 濃度為1.0 mg/mL 的C-1 胞外多糖液，抑菌活性同樣以抑菌圈直徑表示。

2 實驗結果

2.1 C-1 全發酵液上清抑菌活性

2.1.1 C-1 發酵液上清的平板抑菌試驗

根據1.4.1 的設計進行平板抑菌試驗，得到如表1 的抑菌結果。陽性對照為敏感抗生素，濃度為25 μg/mL，陰性對照為滅菌蒸餾水，上清液和胞外多糖液含胞外多糖濃度均為1.0 mg/mL，加樣量均為100 μL。

表1 C-1 上清液的平板抑菌試驗結果(n=3)Table 1 Result of antimicrobial activity of C-1supernatant (n=3)

由該表數據得知，C-1 上清液對蠟樣芽孢桿菌MS10362R，梭狀芽孢桿菌QB21，大腸桿菌ATCC 25922 的抑菌效果比較顯著。

2.1.2B.cereusMS10362R 在C-1 發酵液作用下的生長曲線

圖1 B.cereus MS10362R 在C-1 上清液抑制作用下的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of B.cereus MS10362R treated by C-1 supernatant

選取上述敏感菌株蠟樣芽孢桿菌MS10362R 進行生長曲線試驗。分為高劑量、低劑量和對照組三組，均為培養基150 mL，根據預實驗結果，分別加入上清液4、0.6、0 mL 并用培養基補足使三者液體總量一致，結果如圖1。

圖1 中對照組和低劑量組曲線基本重合，在接種2 h 后即進入對數期，而高劑量組則在接種10 h后進入對數期，表明高劑量B.amyloliquefaciensC-1發酵上清液對于該細菌的生長具有抑制作用，三組在對數期曲線斜率沒有明顯差異。由于三組差異在適應期，需排除因C-1 發酵上清液量不一致導致的物理因素影響，三組唯一可能差別為pH。為了排除由于 C-1 發酵上清液的引入導致B.cereusMS10362R 培養基起始pH 的差異而出現的生長受抑制的情況，對接種前，加入不同體積C-1 發酵上清液后的三組培養基的pH 做了測定，結果如表1。

表2 C-1 發酵液上清加入后對B.cereus MS10362R 培養基起始pH 的改變Table 2 pH variation of B.cereus MS10362R culture medium with addition of C-1supernatant

表2 中三組培養基的pH 差別不明顯，高劑量組和低劑量組的起始pH 非常接近，對照組與其他兩組略有差別，因此若以pH 差異為由解釋圖1 明顯不合理，固可排除pH 等物理因素的影響，確認C-1 發酵上清液中確實存在某種具有抑菌活性的物質。

生長曲線試驗中還發現C-1 發酵上清液對于蠟樣芽孢桿菌產黑色素具有明顯的抑制作用。如圖2。

圖2 蠟樣芽胞桿菌MS10362R 在C-1 發酵上清液作用下的黑色素產量變化Fig.2 The melanin production of B.cereusMS10362Rtreated byC-1supernatant

可見在84 h 時對照組顏色深、產色素量大，明顯區別于低劑量和高劑量組，后兩者顏色相差不大產黑色素量基本一致，直到120 h，三組產黑色素量才基本相等。同時在B.cereusMS10362R 培養至48 h 以后各組間的細胞數(OD600)基本一致，所以黑色素的產量差異與細胞數量無關聯。

2.2 C-1 胞外多糖抑菌活性

表2 結果顯示C-1 粗提胞外多糖對于所用9 株受試菌均不敏感，可以初步確定單純的胞外多糖液(EPS 液)不具有抑菌活性。

表2 C-1 上清液及胞外多糖的平板抑菌試驗結果(n=3)Table 2 Result of antimicrobial activity of C-1supernatant and EPS (n=3)

3 討論和展望

解淀粉芽孢桿菌分布廣泛，菌種資源豐富，培養較簡單，在較寬譜的pH 和溫度范圍內都能很好的生長，且代謝產物種類繁多，具有廣泛的細菌真菌抑菌活性，但由于分離株眾多，抑菌譜不一，發酵效率一般，某些代謝產物低毒性［17］(尚無致病性報道)等原因，在生產生活實踐中還沒有得到廣泛的應用，隨著分子生物學的發展，解淀粉芽孢桿菌的發酵效率，毒性產物與抑菌活性等能得到很好的調和，其在生物防治方面的應用可行性將得到很好的提升。

本實驗發現100 μL 解淀粉芽孢桿菌C-1 發酵液能抑制蠟樣芽孢桿菌MS10362R，梭狀芽孢桿菌QB21，大腸桿菌ATCC 25922 的生長，與100 μL 25 μg/mL 的相應敏感抗生素陽性對照比較，其抑菌效率可 達 到 50%～60% (表 1)。對B.cereusMS10362R 來講，4 mL 的解淀粉芽孢桿菌C-1 發酵液可以顯著的延長其生長遲緩期，將MS10362R 到達對數期的時間由原來的2 h 推遲至10 h(圖1)，如果將該物質分離用于食品防腐劑上，可以在一定程度上延長食品貨架期;同時結果顯示C-1 上清液可以抑制B.cereusMS10362R 黑色素的產生。由于細菌色素屬于次級代謝產物，往往在細菌細胞密度達到一定時才產生，提示C-1 發酵液抑制B.cereusMS10362R 黑色素產生可能與阻礙細菌的群體感應(quorum sensing，QS)和自誘導物質(auto-inducer，AI)有一定的關系［18］。初步推斷C-1 發酵液抑制色素產生可能與抑制AI 釋放有關。那么C-1 發酵液是否能通過同樣的機制抑制毒素等其他細菌的次級代謝產物產生呢?目前還沒有相關的報道，這對于新型抗生素靶點的研究開發具有顯著地意義。比如對于甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MARS)感染的患者，病人膿毒血癥十分嚴重，由于耐藥，沒有抗生素能殺滅細菌，但是如果能通過抑制AI 的產生及其濃度，或許可以抑制細菌毒素釋放，病人的癥狀必將得到緩解，細菌也因為不能產生次級代謝產物而抑制自身的生長繁殖［19］。

本實驗證明從解淀粉芽孢桿菌C-1 發酵液上清中分離出的胞外多糖不具有抑菌效果，因此可以初步確定發酵液上清中具有抑菌活性的物質可能是蛋白類或多肽類等物質，仍需要進一步分離，并進行功能研究。

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