響應面法優化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工藝

遲曉峰，董 琦，胡風祖

中國科學院西北高原生物研究所 中國科學院藏藥研究重點實驗室，西寧 810008

康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)為唇形科鼠尾草屬植物，產四川西部、西北部、青海省南部;分布于海拔3750～4000 m 的山坡草地上［1］。迷迭香酸(rosmarinic acid，Ros A 分子式C18H16O8)是由一份子咖啡酸和一分子3，4-二羥基苯基乳酸(即丹參素)的縮合物，為有活性的水溶性的多酚類化合物。迷迭香酸具極強的清除體內自由基的活性和抗氧化作用［2］;抗血栓作用［3］;以及抑制HIV-1 逆轉錄酶的活性［4］。初步實驗發現，康定鼠尾草中迷迭香酸含量較高，有較大開發利用價值，因此，本實驗采用響應面分析法對主要因素進行優化，確定較優的提取工藝方法，為大批量生產提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

康定鼠尾草根采自青海省玉樹自治州，經中國科學院西北高原生物研究所陳世龍研究員鑒定為唇形科植物康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)。迷迭香酸對照品由上海同田生物技術有限公司提供，甲醇為色譜純和優級純，H3PO4、無水乙醇，均為分析純。

美國Waters 515 型高效液相色譜儀:二元梯度泵，Waters 2996 紫外檢測器，EMPOWER 色譜工作站;KQ-100E 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器科技有限公司);MOLELEMENT 元素型超純水機(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2 迷迭香酸的測定

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取迷迭香酸標準品2.29 mg，用甲醇溶解，定容于10 mL 的容量瓶，其質量濃度為0.229 mg/mL。

1.2.2 色譜條件

LiChrospher Cl8柱(4.6 mm ×250 mm i.d.，5 μm);流動相:甲醇:水(0.1% H3PO4)=40∶60;紫外檢測波長:330 nm;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL，柱溫:30 ℃。

1.2.3 樣品測定

分別制備不同的康定鼠尾草供試品，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，測定樣品中迷迭香酸的含量，樣品和對照品的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 樣品與對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and samples

1.3 單因素實驗

在進行響應面分析之前，先通過單因素實驗選出對康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率具有顯著影響的因素，并確定其實驗水平。本文考察不同乙醇濃度、液料比、提取時間和提取次數對康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率的影響。

2 結果與討論

2.1 迷迭香酸測定方法學考察

2.1.1 精密度實驗

準確吸取混合標準溶液10 μL 重復進樣5 次，測得各標準峰面積，計算RSD 值為:0.93%。實驗表明，在該條件下精密度良好。

2.1.2 重現性實驗

精密吸取同一批樣品溶液，進樣6 次，測定樣品中迷迭香酸的量。測得各峰面積，計算RSD 值為:1.19%。實驗表明，迷迭香酸的測定結果重現性良好。

2.1.3 穩定性實驗

取同一批供試品溶液，按含量測定法分別在0、4、8、12、24 h 進樣，測定樣品中迷迭香酸的含量。測定各目的峰面積，計算RSD 為:0.87%。實驗表明，供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.1.4 回收率實驗

準確稱取0.500 g 的樣品9 份，取1.2.1 述標準溶液依次加50、100、150 μL 于每3 份樣品中，按樣品的測定方法提取及測定。以9 次測定的平均值計算回收率分別為:100.3%，RSD 為1.9%。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇濃度對迷迭香酸提取得率的影響

設定液料比15∶1、超聲60 min、溫度20 ℃、提取次數為兩次的條件下，不同乙醇濃度對迷迭香酸得率的影響。結果表明隨著乙醇濃度的提高，迷迭香酸得率呈上升趨勢，當乙醇濃度達到40%時迷迭香酸得率最大，之后隨著濃度的增加，得率反而降低。因此選擇40%左右乙醇濃度作為較佳的提取溶劑。

2.2.2 液料比對迷迭香酸提取得率的影響

設定乙醇濃度40%、超聲60 min、溫度20 ℃、提取次數為兩次的條件下，不同液料比對迷迭香酸得率的影響。結果表明，迷迭香酸得率隨著溶劑量的增加而增加，這是由于溶劑用量增加，藥材與溶劑接觸面增加，有利于擴散速度的提高。在液料比達到15∶1 后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不變。由此確定迷迭香酸提取的液料比以15∶1 為宜。

2.2.3 提取時間對迷迭香酸提取得率的影響

設定乙醇濃度40%、液料比15∶1、溫度20 ℃、提取次數為兩次的條件下，不同超聲時間對迷迭香酸得率的影響。結果表明，超聲10～50 min 內迷迭香酸得率呈上升趨勢，然后隨時間的延長含量基本不變。由Fick 擴散定律可知得率與提取時間呈正比，在一定條件下，超聲時間越長得率越高;但時間太長會使擴散次數降低，反而影響迷迭香酸的得率，因此，本實驗選擇超聲時間為50 min。

2.2.4 提取次數對迷迭香酸提取得率的影響

設定乙醇濃度40%、液料比為15 ∶1、超聲60 min、溫度20 ℃的條件下，不同提取次數對迷迭香酸得率的影響。結果表明，提取兩次后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不變。由此確定迷迭香酸提取的次數以兩次為宜。

2.3 響應面實驗及其結果

2.3.1 響應面方案設計

根據單因素初篩試驗結果，分別確定乙醇濃度、液料比、提取時間為因素，每個因素三個水平進行實驗，因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken 因素及水平安排表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2.3.2 響應面分析結果

取康定鼠尾草干燥根，精密稱定，由Box-Behnken 設計方案所得的試驗條件進行試驗，實驗結果見表2。

采用Design-Expert7.0 軟件對表2 結果進行響應面回歸分析，得擬合方程 Y=-77.77817 +0.75745 × X1+0.38609 × X2+1.49770 × X3-0.00075875 × X1 × X2+0.0008375 × X1 × X3-0.0016125 ×X2 ×X3-0.00777042 ×X12-0.00122385×X22-0.094698 ×X32，對該方程的回歸分析和方差如表3 所示。

由表3 可以看出，方程的因變量和自變量之間線性關系明顯，該模型和失擬項均顯著，并且該模型的R2=0.9897，表明該二次回歸得到的迷迭香酸提取率模型與實際擬合較好，符合度為98.97%，表明使用該方程模擬實際的三因素三水平的分析是可行的。同時由F 值得大小可以推斷，在所選擇的實驗范圍內，3 個因素對迷迭香酸提取率影響的排列順序為:乙醇濃度(X3)＞提取時間(X2)＞料液比(X1)

表2 Box-Behnken 設計方案及響應值Table 2 Box-Behnken design and response values

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

圖2 時間和料液比對迷迭香酸得率的影響Fig.2 Response surface plot showing the effects of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of rosmarinic acid

圖3 時間和乙醇濃度對迷迭香酸得率的影響Fig.3 Response surface plot showing the effects of extraction time and ethanol concentraion on extraction yield of rosmarinic acid

圖4 料液比和乙醇濃度對迷迭香酸得率的影響Fig.4 Response surface plot showing the effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on extraction yield of rosmarinic acid

響應面圖形是響應值對各因素(X1、X2、X3)所構成的三維空間的曲面圖，從圖2～4 上可形象地看出各因素交互作用對響應值的影響。比較圖2～4可知，乙醇濃度數對迷迭香酸得率的影響最為顯著，表現為曲線較陡，乙醇濃度最佳值在40%左右;而時間和料液比次之，表現為曲線較為平滑，其最佳響應值分別在50 min 和15∶1 左右。

2.4 最優條件的確定

通過回歸模型預測的迷迭香酸提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度38.44%，液固比15.56∶1，時間50.57 min，在此條件下，迷迭香酸理論上可達12.37 mg/g。

考慮到實際操作的可行性，將迷迭香酸的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為∶乙醇濃度40%，液固比15∶1，提取時間50 min。

3 結論

本實驗以康定鼠尾草根為原料，對迷迭香酸進行了超聲提取工藝的研究。采用響應面分析法對乙醇濃度、液固比、超聲時間進行優化，確定提取溶液為40%乙醇、液固比15∶1、提取50 min，在此條件下迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸得率可達12.30 mg/g。通過該提取工藝的研究，為工業生產迷迭香酸提取物提供科學的參考依據。

1 Flora of China，Chinese Academy of Sciences Editorial Commission(中國科學院中國植物志編委會).Flora of China(中國植物志).Beijing:Science Press，1977.Vol 66，70-71.

2 Huang ZS(黃治森)，Zhang JT (張均田).Antioxidant properties of three water-solubility components fromSalvia miltiorrhiza.Acta Pham Sin(藥學學報)，1992，27:96-100.

3 Petersen M，Simmonds MS.Rosmarinic acid.Phytochemistry，2003，62:121-125.

4 Hooker CW，Lott WB，Harrich D.Inhibitors of human immuno-deficiency virus type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription.J Virol，2001，75:3095-3104.