燈盞細辛提取物對2 型糖尿病小鼠氧化損傷的保護作用研究

王建勇，楊慶雄，黃小燕*

1貴州師范大學生命科學學院;2 貴州師范大學化學與材料科學學院，貴陽 550001

燈盞細辛［Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.］是菊科(Compositae)飛蓬屬(Erigeron)植物，產于湖北、廣西、貴州、四川、云南及西藏等省區。臨床主要用于治療腦血栓形成、腦栓塞等［1，2］;本課題前期研究發現，燈盞細辛提取物具有改善2 型糖尿病模型動物糖代謝，調節血脂等作用［3，4］，但具體機制尚不明確，本研究將從燈盞細辛提取物抗氧化以及對肝臟、胰腺損傷的保護作用，探討其改善糖代謝、調節血脂的相關機制。

1 材料與儀器

1.1 燈盞細辛提取物的制備

燈盞細辛，采自云南彌勒，由中國科學院昆明植物研究所楊崇仁研究員鑒定;干燥燈盞細辛藥材經粉碎后，用70%乙醇熱回流提取三次，合并提取液，回收溶劑，得燈盞細辛總提取物?？偺崛∥锝浰宜嵋阴ポ腿∪危喜⒁宜嵋阴セ厥杖軇┑脺\棕色粉末，總酚粉末經大孔樹脂柱層析進一步純化，得到供試藥粉末，冰箱保存備用，實驗時按要求配制相應濃度藥液。

1.2 試驗動物

選取健康成年KM 種小鼠，體重18～20 g，雌雄各半，購于第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所醫學實驗動物中心，合格證號:SCXK(渝)2001-0005。分籠飼養于貴州省貴陽中醫學院藥理教研室實驗室。動物適應性喂養1 周后開始實驗。室溫18～28 ℃，相對濕度62%～80%。

1.3 主要試劑

高糖高脂飼料(蛋黃2.5%，蔗糖20%，豬油10%，基礎飼料67.5%);生理鹽水(重慶大新藥業股份有限公司，批號:09082210);95%醫用酒精(貴州宏泰工貿保健品廠，批號:09082305);四氧嘧啶(SIGMA 公司，批號:L7424);鹽酸吡格列酮片(江蘇德源藥業有限公司，生產批號:11110351);膽固醇測定試劑盒(批號:BD1315)、甘油三酯測定試劑盒(批號:BA1293，Siemens Healthcare Diagonstics Inc.);總超氧化物歧化酶(T-SOD 生產批號:20120903)測定試劑盒、丙二醛(MDA 生產批號:20120905)測定試劑盒:購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

1.4 主要儀器

UV-1800 型紫外-可見分光光度計(日本島津有限公司);穩豪血糖儀(強生公司);恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);電子天平(美國丹佛);TG16-W 微量高速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);OLYMPUS 光學顯微鏡［日本奧林巴斯(中國)有限公司］;MIAS-4400 顯微圖像分析系統(北京炳洋科技有限公司)等。

2 試驗方法

2.1 動物前期飼養及處理

，建立2 型糖尿病實驗動物模型［5］，試驗期間，嚴格按照動物飼養管理標準和規范進行飼養。隨機選取出20 只小鼠喂普通飼料，自由飲水，其余小鼠喂高糖高脂飼料，自由飲水。喂養8 周后，兩組各隨機抽取4 只小鼠禁食不禁水12h，摘眼球取血，3000 rpm 離心5 min，取血清，進行血脂檢測，喂高糖高脂飼料的小鼠血清中TC、TG 較對照組顯著升高(P＜0.01)，表明高脂動物模型建模成功。取高脂模型小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射小劑量四氧嘧啶(180 mg/kg)。72 h 后，對小鼠進行尾尖取血，用血糖儀檢測小鼠空腹血糖(檢測前12 h 禁食不禁水)，以血糖值≥10 mmol/L 為建立2 型糖尿病模型標準，篩選造模成功動物。

2.2 動物分組及處理

選取喂養普通飼料的小鼠10 只作為正常對照組;2 型糖尿病模型小鼠按血糖值隨機分成4 組，每組10 只，分別為模型組、燈盞細辛提取物高(200 mg/kg·d)、低劑量組(100 mg/kg·d)，吡格列酮(100 mg/kg·d)組，灌胃給藥，0.1 mL/10 g 體重，連續15 d。正常對照組給予等體積生理鹽水。除正常對照組外，其余各組繼續喂高糖高脂飼料。末次給藥1 h 后，小鼠眼球取血，3000 rpm 離心5 min，分離血清。取血后小鼠立即采用頸椎脫臼處死，取肝臟和胰腺組織，分別放于10%的福爾馬林中固定。

2.3 測定方法

嚴格按照試劑盒說明書分別進行測定，T-SOD酶活性測定采用黃嘌呤氧化酶法;MDA 濃度測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，檢測血清SOD 酶活性及MDA 濃度。病理切片采用常規HE 染色觀察，觀察胰腺外分泌部腺泡細胞和肝細胞變性及壞死，炎癥細胞浸潤，間質水腫，血管反應，纖維增生。上述病變占組織塊的30%以下1 分，占30%～50%之間2分，占50%以上3 分，將所有評分累加即胰腺和肝臟損傷的評分。

2.4 數據統計

數據用SPSS 16.0 統計軟件進行處理，所得統計結果均以平均數±標準差表示，進行正態性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05作為顯著性差異，P＜0.01 作為極顯著性差異。

3 試驗結果

3.1 燈盞細辛提取物對小鼠血清中T-SOD 活力和MDA 含量的影響

結果表明(表1)，模型組與正常組相比，血清中T-SOD 活力顯著降低(P＜0.01)，血清中MDA 含量顯著升高(P＜0.01);燈盞細辛提取物低劑量組與模型組相比，血清中T-SOD 活力顯著升高(P＜0.05)，血清中MDA 含量顯著降低(P＜0.01);燈盞細辛提取物高劑量組與模型組相比，血清中T-SOD活力顯著升高(P＜0.01)，血清中MDA 含量顯著降低(P＜0.01);其中燈盞細辛提取物高劑量組與燈盞細辛提取物低劑量組相比，對提高血清T-SOD 活力的作用效果差異不顯著(P＞0.05)，對降低血清中MDA 含量的作用效果差異也不顯著(P＞0.05)。由結果可以看出，燈盞細辛提取物能夠顯著提升2型糖尿病小鼠血清T-SOD 的活力，降低其血清中MDA 的含量，具有較強的體內抗氧化活性。

表1 小鼠血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及丙二醛(MDA)含量的測定結果Table 1 The T-SOD activities and MDA concentrations of mice serums in different groups

3.2 燈盞細辛提取物對2 型糖尿病模型小鼠胰腺、肝臟病理改變的影響

3.2.1 小鼠胰腺組織病理損傷評分

病理切片檢測表明，正常組小鼠胰腺組織中見個別腺泡細胞變性，其余腺泡細胞無變性壞死，偶見間質血管充血及炎癥細胞浸潤，未見間質水腫。與正常組相比，模型組小鼠胰腺組織中腺細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分非常明顯;與模型組相比，燈盞細辛高劑量組和燈盞細辛低劑量組小鼠胰腺組織中腺細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分明顯較少，通過組織病理損傷評分結果表明，燈盞細辛提取物對2 型糖尿病小鼠胰腺組織損傷具有一定的改善作用。評分結果見表2。

表2 HE 觀察小鼠胰腺組織病理損傷評分(± s)Table 2 Scores of pathological damages of pancreas tissue of mice in different groups(± s)

表2 HE 觀察小鼠胰腺組織病理損傷評分(± s)Table 2 Scores of pathological damages of pancreas tissue of mice in different groups(± s)

3.2.2 小鼠肝臟組織病理損傷評分

病理切片檢測表明，正常組小鼠肝臟組織中見個別肝細胞變性，其余肝細胞無變性壞死，偶見間質血管充血及炎癥細胞浸潤，未見間質水腫。與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中肝細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分非常明顯;與模型組相比，燈盞細辛高劑量組和燈盞細辛低劑量組小鼠肝臟組織中肝細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分明顯較少，通過組織病理損傷評分結果表明，燈盞細辛提取物對2 型糖尿病小鼠肝臟組織損傷具有一定的改善作用。評分結果見表3。

4 討論

圖1 胰腺組織病理切片(400X)Fig.1 Pathological sections of pancreas tissues (400X)

表3 HE 觀察小鼠肝臟組織病理損傷評分(± s)Table 3 The scores of pathological damage of liver tissue of mice in different groups(± s)

表3 HE 觀察小鼠肝臟組織病理損傷評分(± s)Table 3 The scores of pathological damage of liver tissue of mice in different groups(± s)

圖2 肝臟組織病理切片(400X)Fig.2 Pathological sections of liver tissues (400X)

大量動物實驗和臨床研究證明，患糖尿病時存在著明顯的氧化應激效應［6］，糖尿病活性氧增多的確切機制尚未完全闡明，可能的原因:升高的血糖和糖化血紅蛋白自氧化使自由基的產生增加，機體抗氧化系統清除自由基的能力減弱，葡萄糖自氧化產生的醛基進一步氧化修飾蛋白質，導致蛋白質結構和功能改變而參與氧化應激［7］。正常機體內自由基代謝維持動態平衡，是由于存在有效的自由基清除系統。動物體內源性自由基清除系統包括酶和非酶抗氧化系統。SOD 是生物酶系統抗氧化劑，MDA是氧自由基引起的脂質過氧化反應所產生的脂質過氧化物在機體內的代謝終產物，能夠間接地反映機體內氧自由基代謝狀況、機體組織細胞受自由基攻擊的程度及脂質過氧化程度［8］。由本實驗結果可以看出，燈盞細辛提取物能夠顯著提升2 型糖尿病小鼠血清T-SOD 的活力，降低其血清中MDA 的含量，能夠有效清除體內活性氧自由基和脂質過氧化物，保護機體免受自由基的損傷。

研究發現，2 型糖尿病發生中，常同時存在脂代謝紊亂，超過一半的2 型糖尿病患者合并脂代謝紊亂，造成脂肪酸在胰島內沉積，導致胰島細胞的“脂毒性”和“脂凋亡”，繼而引起胰島功能衰竭［9］。肝臟有大量胰島素受體，肝臟得不到滋養時，必然會使代謝產生的有害物質積聚，進一步損傷肝細胞線粒體，使其能量供應受損，核糖體合成蛋白質的活性下降，肝臟合成蛋白質的能力減弱。而肝臟、胰腺的損傷又進一步加劇了血糖及脂肪代謝的紊亂。本研究表明，燈盞細辛提取物對2 型糖尿病小鼠胰臟、肝臟組織損傷具有一定的改善作用，可以減輕模型動物肝臟及胰腺組織炎癥細胞浸潤及變性、水腫等。

綜上研究結果，燈盞細辛提取物能夠改善血糖代謝以及血脂代謝與其有效清除體內活性氧自由基和脂質過氧化物以及對肝臟和胰腺的保護作用有關。

參考文獻

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3 Dang CZ(黨翠芝)，Huang XY(黃小燕)，Yang QX(楊慶雄).Antioxidant activity of constituents fromErigeron breviscapus.China J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2012，18:100-103.

4 Huang XY(黃小燕)，Dang CZ(黨翠芝)，Yang QX(楊慶雄).The effect of extracts fromErigeron breviscapusplants on treating type 2 diabetic hyperlipidemia.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2013，24:847-849.

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