構樹種子油的超聲強化提取及其抗氧化性研究

瞿曉晶，彭芳芳，尹楹富，譚瑩瑩，權春善

大連民族學院生命科學學院，大連 116600

構樹［Broussonetia papyrifer(L.)Vent.］為桑科直立落葉喬木，分布在我國華北、西北、華東、中南、西南及遼寧［1］，多為野生，長于山坡、溝邊，有少量栽培。構樹果可生食，亦可釀酒，有補腎、壯筋骨、健胃消腫之功效，構樹皮、白色汁液均可入藥。臨床上用于治療腰膝酸軟、虛勞骨蒸、頭暈目昏、目生膜、水腫脹滿，還可以治療頑癬、神經性皮炎、濕疹等皮膚病［2］。《名醫別錄》載為上品:甘、寒、無毒。古本草多記載楮實子(構樹果實)為補益藥，功用大補益，久服不饑、不老，輕身［3］。現代藥理研究表明:構樹果實具有促進記憶、調節免疫，降血脂，抗氧化作用，且對肝病、腎病、眼病、男女不孕不育癥等疾病都有一定的療效，具有很好的藥用價值，可以被用于生產藥物或保健品。

超聲波提取法是一種新的分離提取技術，現已廣泛應用于油脂工業，具有操作簡便快捷、提取溫度低、提取物的結構不被破壞等優點［4］，目前，超聲波技術已經嘗試用于八角油、扁桃油、玉米胚芽油、松籽油、蘋果籽油、西瓜籽油、辣椒籽油、獼猴桃籽油的提取中。利用高強度、高頻率聲波及其與物質之間相互作用，不但可以破碎植物細胞壁，使被提取物質更易釋放出來，且還可加速溶劑從連續相到植物細胞過程。本文利用超聲波法考察了各種因素對構樹種子油提取率的影響，并對其提取工藝進行了初步研究，為構樹的綜合利用奠定了基礎。

同時，已有研究表明自由基與衰老、癌癥、心血管疾病及炎癥的發生有著密切的關系［5］，而超氧陰離子的過量會導致細胞DNA 損壞，破壞人類機體功能。為進一步研究構樹種子油的功效，拓展其應用市場，本文通過測定構樹種子油對自由基的清除能力以及對超氧陰離子的抑制作用，較為詳細的研究了構樹種子油的抗氧化能力。為構樹種子油在醫藥、食品、化妝品方面的開發利用提供了理論依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料

構樹種子于2010年和2011年7月至9月采與大連民族學院校內。

1.2 儀器與設備

超聲細胞破碎儀(VCX130PB，USA);旋轉蒸發儀(R-200，Switzerland);離心機(NAPCO 2080R，French);分光光度計(Ultrospec 4300pro，Amersham Biosciences);其他均為常規儀器。

1.3 試劑

丙酮、無水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、鹽酸、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)，以上試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 最佳溶劑篩選

分別以無水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷為提取溶劑。通過比較七種溶劑提取效果和溶劑物化性質，篩選出提取構樹種子油最佳溶劑。

2.2 構樹種子油的提取

影響構樹種子油提取率的因素主要有三個:超聲波強度、超聲作用時間和料液比(g/mL)。首先，將構樹種子用研缽研碎，然后稱取質量，每個試管中裝取1 g。最后，參照以下步驟進行實驗。

2.2.1 超聲波強度對構樹種子油提取率的影響

在相同的作用時間5 min 和料液比1 ∶10(g/mL)條件下，用不同的超聲波強度0%、20%、40%、60%、80%、100%分別處理構樹種子，離心，將溶劑倒入圓底蒸餾燒瓶中，通過旋轉蒸發儀將溶劑蒸出。稱量提取出的種子油的質量并按照如下公式計算提取率。

2.2.2 料液比對構樹種子油提取率的影響

保持一定的作用時間(5 min)和超聲強度(60%)，在料液比(g/mL)分別為1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1∶10、1∶14、1∶16 的情況下，對構樹種子油提取率進行測定。

2.2.3 超聲作用時間對構樹種子油提取率的影響

在超聲強度(60%)和料液比(1∶10)條件不變的情況下，改變作用時間，時間(min)分別設定為2、4、6、8、10、12、14，對提取率進行測定。

2.2.4 均勻設計實驗

以影響構樹種子油提取率的超聲波強度、作用時間、料液比為考察因素，各因素取三個水平，探求超聲波強化提取構樹種子油的最佳工藝。

2.3 構樹種子油抗氧化活性的測定

2.3.1 有機自由基(DPPH) 的清除能力

吸取10mL 6.5 ×10-4mol/L DPPH 溶液100 mL容量瓶中定容，搖勻，室溫下避光靜置30 min。分別量取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL 的構樹種子油，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成體積比不同的樣品，編號分別為1、2、3，在517 nm 處測定溶液的吸光值，通過下式計算對DPPH 的清除率:

式中:A0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 丙酮;Ai為2 mL DPPH 溶液+2 mL 樣品;Aj為2 mL 樣品+2 mL 丙酮。每個濃度的樣品重復三次，計算平均值［6］。

鄰苯三酚在堿性條件(pH 8.2)下發生自身氧化反應，釋放超氧陰離子自由基，生成有色中間產物并不斷積累，此反應導致吸光度在波長320 nm 處形成線性積累。若加入超氧陰離子自由基清除劑，吸光度會發生改變。按照配方將樣品與鄰苯三酚溶液混合，測定其吸光度隨時間的變化值，并計算出變化率，將此變化率與對照溶液變化率相比較便可得出構樹種子油對的清除能力［7］。

樣品制備:分別量取40、60、70、80、100 μL 的構樹種子油，用無水乙醇定容至10 mL，配制成不同體積比的樣品。

分別將50 mmol/L Tris-HCl 溶液，30 mol/L 鄰苯三酚溶液和無水乙醇在25 ℃水浴中預熱20 min，以50 mmol/L Tris-HCl 溶液調零，然后按表1 順序迅速加入反應液。

表1 試劑的加入量及順序(mL)Table 1 Quantity and adding order of reagents (mL)

依次添加完試劑后迅速搖勻，在波長320 nm 處測定吸光度，每隔30 s 記錄一次吸光度，在線性范圍內連續記錄10 min，然后計算不同體積比的樣品對超氧陰離子自由基的清除率。

式中:V空為鄰苯三酚自氧化速率;V樣為鄰苯三酚加入樣品后的氧化速率。

3 實驗結果

3.1 溶劑的選擇

通過查閱大量的相關文獻，得出七種提取種子油的常用溶劑，即無水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、和三氯甲烷。利用這些溶劑對構樹種子油進行提取，實驗發現三氯甲烷密度過小，不適合做構樹種子油的溶劑，故本實驗不予考慮。結果如圖1 所示。

圖1 不同試劑對構樹種子油提取率影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction yield of B.papyrifer seed oil

如圖1 所示，丙酮提取率為29.5%，比乙醚低0.9%、比乙酸乙酯低0.3%，但比無水乙醇、石油醚和正己烷的提取率分別高7.80%、3.95%、1.75%。由于丙酮是提取油脂常用試劑，其沸點比構樹種子油沸點低、密度大、毒性小、同時價格較低，所以選用丙酮提取構樹種子油。

3.2 超聲波強化提取構樹種子油

3.2.1 超聲波強度對構樹種子油提取率的影響

按實驗設計稱量研磨構樹種子，在不同超聲波強度下各自提取5 min，料液比(g∶mL)為1∶10，測定提取率，結果見圖2。

圖2 超聲波強度對提取率影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖2 可見，超聲波強度越大，構樹種子油提取率越高。當超聲波強度為20%時，構樹種子油提取率為23%，超聲波強度為40%時，提取率為24%。這是由于超聲波強度越大，空化現象越劇烈，媒質粒子速度和加速度亦越大，界面擴散層上分子擴散就越快［8］，構樹種子油脂滲透出來的速度就越大，但當超聲波強度達到一定值(60%)時，由于構樹種子內滲透壓達到平衡，構樹種子油提取率便趨于穩定。

3.2.2 料液比對構樹種子油提取率影響

在超聲波強度為60%，超聲處理時間為5 min條件下，比較料液比(g/mL)對提取率的影響，結果如圖3 所示。

圖3 料液比對提取率影響Fig.3 Effects of ratio of solid to liquid on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖3 可知，構樹種子油提取率與料液比有關，當料液比(g/mL)為1∶8 時，提取率(28%)要比料液比(g/mL)為1∶4(21.3%)時提取率高6.7%。因為溶劑量增加，會降低溶劑中構樹種子油濃度，增加構樹種子油與溶劑接觸界面處濃度差，從而提高傳質速率，在一定時間內提取率增大。但當料液比為1∶10 時，大部分構樹種子油已被提取出，再增加溶劑用量，提取率基本保持不變，從經濟角度考慮，溶劑用量不宜太大［9］。

3.2.3 超聲波提取時間對構樹種子油提取率影響

當超聲波強度為60%，料液比(g∶mL)為1∶10時，研究處理時間對構樹種子油提取率影響，結果見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響Fig.4 Effects of treatment time on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖4 所示，超聲波處理時間越長，原料顆粒被粉碎機會越多［10］，油脂浸出越充分。當超聲波提取時間為2 min 時，提取率僅為24%，而當提取時間增加到5 min 時，提取率則達26%。且5 min 后，體系滲透壓達到平衡，提取率趨于穩定。可見超聲波能在短時間(5 min)內對構樹種子油進行充分提取。

3.2.4 均勻設計實驗

在以上單因素提取實驗基礎上，為了考察多因素綜合效應，以超聲波強度、料液比、超聲提取時間為因素，以均勻設計法觀察影響提取率的各個因素。超聲波強化提取構樹種子油均勻實驗設計及結果如下。

表2 均勻設計實驗結果Table 2 Experimental results of uniform design

通過均勻設計分析，得到結果如表2 所示，超聲波強化提取構樹種子油最優條件為A65B1∶12C7(實驗3)，即超聲波強度為65%，料液比(g/mL)為1∶12，時間為7 min;各因素對超聲波強化提取構樹種子油影響大小次序為:超聲波強度＞料液比(g/mL)＞超聲時間。

3.3 構樹種子油抗氧化活性的測定

3.3.1 DPPH 自由基的清除能力

構樹種子油對DPPH 自由基的清除能力如圖5所示。由結果可以看出，構樹種子油對DPPH 自由基的清除率隨著油濃度的增加而增加，平均清除率高達91.21%，有顯著的清除能力。

圖5 不同濃度油對DPPH 自由基的清除率Fig.5 Clearance rate of different concentrations of B.papyrifer seed oil to DPPH radicals

3.3.2 超氧陰離子自由基(O-·2) 清除作用

圖6 不同濃度構樹種子油對超氧陰離子抑制曲線Fig.6 Inhibitory curves of different concentrations of B.papyrifer seed oil to superoxide anion

構樹種子油對超氧陰離子自由基(O-·2)的清除作用結果如圖6 所示，通過計算，得出加入構樹種子油后，氧化的速率并沒有減小，故構樹種子油對超氧陰離子自由基的抑制能力很低。

4 結論

提取油脂理想溶劑具有以下特性:對油脂溶解性好、選擇性好;物理、化學性質穩定;無腐蝕性、無毒性;沸點低、易于回收、不殘留;價格低廉，來源廣泛。實際上目前國內外尚無這種理想溶劑，各種溶劑都有一定優缺點［10］，本文通過對構樹種子油最佳溶劑的篩選試驗，得出丙酮是提取構樹種子油的理想溶劑。

利用超聲波產生強烈震動、空化效應等作用，可提高效率、改善油脂品質、節約原料、提高出油率。因此，把超聲波作為生產工藝一種手段，在油脂加工提取中將發揮巨大作用。本文應用超聲波強化提取法對構樹種子油進行提取，由均勻設計法實驗得出構樹種子油最佳提取工藝參數為:超聲波強度為65%，料液比(g/mL)為1∶12，時間為7 min，提取率高達30.2%。

構樹種子油具有較好的清楚羥基自由基的作用，平均清除率高達91.21%。隨著油濃度的增加，抑制率增加。而構樹種子油無清除超氧陰離子自由基的能力。

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