大孔樹脂分離純化陳皮中多甲氧基黃酮類化合物

劉 韶，陽秀娟

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長沙 410008;2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨桂院區(qū)藥劑科，廣西桂林 541100

陳皮是蕓香科柑橘屬植物橘(Citru reticulataBlaneo)及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，其性溫、辛、味苦，歸肺、脾經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效［2］。陳皮中含有多種多甲氧基黃酮類成分，其中川陳皮素和橘皮素含量較高。近年來發(fā)現(xiàn)多甲氧基黃酮類成分具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗誘變等生物活性逐漸成為熱點(diǎn)［3-5］，因此，對(duì)含多甲氧基黃酮陳皮進(jìn)行純化研究很有必要。但該類研究報(bào)道不多［6，7］，多研究其所含的另一類黃酮，如陳皮苷。大孔樹脂是一種多孔的聚合物吸附劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥中有效部位的純化研究［7］，本文以川陳皮素和橘皮素為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選陳皮中多甲氧基黃酮類的大孔樹脂分離純化工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

電子天平(德國Sartorius 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城R-1001N);恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司);Agilent-1100 型液相色譜儀器(包括G1311A 四元梯度泵、G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A 柱溫箱、G1313A 二極管陣列檢測(cè)器，美國安捷倫科技有限公司)。

陳皮(產(chǎn)地:江西，批號(hào):201207061)，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部劉韶主任藥師鑒定為蕓香科柑橘屬植物橘(Citru reticulataBlaneo)的干燥成熟果皮;D101 型大孔吸附樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);DM130 型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司);川陳皮素和橘皮素對(duì)照品(陜西永健制藥有限公司，純度≥98%);乙腈(色譜純);乙醇(分析純);純化水(自制)。

1.2 川陳皮素和橘皮素的含量測(cè)定

1.2.1 色譜條件［8，9］

色譜柱為XB-C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相為乙腈-水(50∶50);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長330 nm;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置50 mL 容量瓶中，加適量無水乙醇，使之溶解，再加無水乙醇定容至刻度，搖勻、即可。精密量取川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、4、6、8、10 mL 分別置10 mL 容量瓶中，各加無水乙醇混勻，再定容至刻度、搖勻。用HPLC 測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程。

精密量取橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加適量無水乙醇，使之溶解，再加無水乙醇定容至刻度、搖勻，即可。精密量取橘皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1、2、3、4 mL 分別置10 mL 容量瓶中，各加無水乙醇混勻，再定容至刻度、搖勻。用HPLC 測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程。

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取陳皮藥材500 g，以85%的乙醇10 倍量提取2 次，每次提取1h，過濾，合并濾液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，再用30%乙醇溶解，并定容至1000 mL 作為樣品液，放冰箱(4 ℃)中備用。

1.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定川陳皮素、橘皮素的峰面積，計(jì)算精密度的RSD。取供試品溶液，自溶液配制后分別在0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定川陳皮素、橘皮素峰面積，計(jì)算穩(wěn)定性的RSD。精密稱定陳皮粉末6 份，每份約1 g，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，以峰面積計(jì)算，得到川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD。

1.3 大孔樹脂預(yù)處理

將未處理的大孔樹脂用適量95%乙醇浸泡過夜，倒出乙醇，用純化水洗，并濕法裝柱，再用純化水洗至流出液無醇味，備用。

1.4 大孔樹脂的種類篩選

將已預(yù)處理的D101、DM130 型大孔樹脂分別稱取1 g 于帶磨口塞的錐形瓶中，各加入適量陳皮樣品液，靜置過夜，過濾后得吸附后溶液。往過濾后的樹脂中，各加95%乙醇適量，靜置過夜，過濾后得解吸后溶液。重復(fù)試驗(yàn)3 次，用HPLC 法測(cè)定各樣品中的川陳皮素和橘皮素，按下式分別計(jì)算吸附量和解吸率。

式中:C、V 分別是陳皮樣品液的濃度(mg/mL)和體積(mL)，C1、V1 分別是吸附后溶液的濃度(mg/mL)和體積(mL)，M 是樹脂的質(zhì)量(g)，C2、V2 分別是解吸液的濃度(mg/mL)和體積(mL)［6］。

1.5 洗脫劑乙醇濃度的確定

取約20 g 已預(yù)處理的D101 型大孔樹脂3 份，濕法裝柱，取陳皮樣品液70 mL 上柱，用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質(zhì)，再將第一份樹脂柱用6 BV 70%乙醇繼續(xù)洗脫，第二份樹脂柱用6 BV 80%乙醇繼續(xù)洗脫，第三份樹脂柱用6 BV 95%乙醇繼續(xù)洗脫，分別吸取每份的上樣液、流出液和洗脫液測(cè)定，按文獻(xiàn)方法［10］計(jì)算川陳皮素、橘皮素的吸附量及洗脫率。

1.6 洗脫劑用量的考察

取約20 g 已預(yù)處理的D101 型大孔樹脂濕法裝柱，取陳皮樣品液70 mL 上柱，用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質(zhì)，再用6 BV 80%乙醇洗脫，每2 BV 一份，共3 份。依次吸取上樣液、流出液和洗脫液測(cè)定，并計(jì)算川陳皮素、橘皮素的洗脫率。

1.7 上樣液濃度的考察

取約20 g 已預(yù)處理的D101 樹脂兩份分別濕法裝柱，將質(zhì)量濃度為167 mg/mL 和500 mg/mL 的陳皮樣品液上柱，吸附過夜后，先用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質(zhì)，再用6 BV 80%乙醇洗脫，流速1.5 mL/min。依次吸取上樣液、流出液和洗脫液測(cè)定并計(jì)算川陳皮素和橘皮素的吸附量及洗脫率。

1.8 工藝重復(fù)性考察

按確定好的吸附、洗脫條件，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，依次吸取流出液和洗脫液測(cè)定，計(jì)算川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率。另取陳皮樣品液和三次80%乙醇洗脫液倒入已恒重好的蒸發(fā)皿中在70 ℃水浴鍋上蒸干，再放入105 ℃烘箱中烘4 h，再取出，放到干燥器中干燥1 h，稱重，計(jì)算浸膏得率(浸膏得率=浸膏量/樣品液中所含藥材的量×100%)，并測(cè)定浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量。

1.9 樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察

取陳皮樣品液，按前述條件進(jìn)行試驗(yàn)，在同一根柱上重復(fù)操作4 次，分別測(cè)定、計(jì)算出川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC 含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

川陳皮素和橘皮素對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1，從圖中可以看出，各組分分離度良好。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得川陳皮素和橘皮素線性方程分別為Y=17721X+15.763，R2=0.9999;Y=23898X-14.467，R2=0.9997。表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)中川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.2%和1.1%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.5%和0.9%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)中，川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.4%和1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 川陳皮素對(duì)照品(A)、橘皮素對(duì)照品(B)及陳皮樣品(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of nobiletin (A)，tangeretin (B)and orange peel sample (C)1:川陳皮素nobiletin;2:橘皮素tangeretin

2.2 大孔樹脂類型篩選結(jié)果

D101、DM130 型大孔樹脂對(duì)陳皮樣品液中川陳皮素和橘皮素的吸附量及解吸率見表1。3 次試驗(yàn)結(jié)果基本一致，2 種樹脂對(duì)川陳皮素和橘皮素的吸附量以及解析率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5%。D101型大孔樹脂對(duì)川陳皮素和橘皮素的吸附量稍大于DM130 型樹脂，解吸率也高于DM130 型樹脂，因此選用D101 型大孔樹脂。

表1 不同樹脂對(duì)陳皮樣品液中川陳皮素和橘皮素的吸附量及解吸率(n=3)Table 1 The adsorption and desorption rate of different resins for nobiletin and tangeretin (n=3)

2.3 洗脫劑乙醇濃度考察結(jié)果

不同濃度乙醇的洗脫效果見表2。從表2 可知，80%乙醇和95%乙醇的洗脫效果都比較好。對(duì)于川陳皮素，80%乙醇和95%乙醇的洗脫率接近，而對(duì)于橘皮素，80%乙醇的洗脫率則較95%乙醇的洗脫率稍低，但也能達(dá)到85.9%的洗脫率。因此，綜合因素考慮選用80%乙醇。

2.4 洗脫劑用量的考察

從圖2 中可以看出，第一個(gè)2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達(dá)到54.14%，橘皮素的洗脫率達(dá)到20.00%，第二個(gè)2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達(dá)到39.65%，橘皮素的洗脫率達(dá)到46.84%，第三個(gè)2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達(dá)到5.34%，橘皮素的洗脫率達(dá)到19.06%。即6 BV 80%乙醇洗脫后，川陳皮素總的洗脫率達(dá)到96.13%，橘皮素總的洗脫率達(dá)到85.9%，表明當(dāng)80%乙醇用量為6 BV 時(shí)已基本上將這兩種多甲氧基黃酮洗脫完全，因此確定樹脂的最佳洗脫量為6 BV。

表2 洗脫劑乙醇濃度的考察結(jié)果Table 2 Effects of ethanol concentration on desorption rate of nobiletin and tangeretin

2.5 上樣液濃度的考察

D101 樹脂對(duì)不同濃度樣品溶液中的川陳皮素和橘皮素的吸附量，解吸率見表3。從表3 可以看出，500 mg/mL(以陳皮藥材計(jì))為較佳的上樣濃度。

圖2 洗脫劑用量的考察Fig.2 Effects of eluent dosage on desorption rate of nobiletin and tangeretin

表3 上樣液濃度的考察結(jié)果Table 3 Effects of sample concentration on desorption rate of nobiletin and tangeretin

2.6 工藝重復(fù)性考察

表4 為重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次的結(jié)果。三次實(shí)驗(yàn)中，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都接近，說明在同等條件下實(shí)驗(yàn)，能達(dá)到穩(wěn)定的吸附和洗脫。陳皮樣品液和三次實(shí)驗(yàn)中80%乙醇洗脫液的浸膏得率及浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量見表5。從表5 的結(jié)果能夠看出，陳皮樣品液通過D101 型大孔樹脂的分離純化后浸膏得率下降，而浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量增加。浸膏中川陳皮素的含量由純化前2.54%到純化后變?yōu)?1.96%，提高了3.7倍;浸膏中橘皮素的含量由純化前1.22%到純化后變?yōu)?.11%，提高了3.2 倍。

表4 工藝重復(fù)性考察的結(jié)果Table 4 The results of process repeatability

表5 純化效果考察結(jié)果Table 5 The results of purification effect

2.7 樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察

樹脂重復(fù)使用次數(shù)越多，其洗脫量會(huì)下降，洗脫率也會(huì)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表6)表明:重復(fù)使用3次，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都變化不大。使用第4 次后，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都有所下降。因此，樹脂重復(fù)使用3 次后，要進(jìn)行活化處理。

表6 樹脂重復(fù)使用次數(shù)考察結(jié)果Table 6 The repeated using times of resin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的純化目標(biāo)成分是川陳皮素和橘皮素等多甲氧基黃酮類成分，紫外光分光光度法、HPLC 法均可以用來測(cè)定其含量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定樣品中的川陳皮素和橘皮素，并以它們?yōu)樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選大孔樹脂分離純化工藝，可信度更高、更能反映純化工藝的情況。

樹脂的類型，洗脫的濃度，洗脫劑的用量，上樣液的濃度等對(duì)川陳皮素和橘皮素等多甲氧基黃酮類成分的純化工藝影響較大。本實(shí)驗(yàn)首先通過參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)川陳皮素和橘皮素的結(jié)構(gòu)特征和樹脂性質(zhì)，排除了多種樹脂，只選用D101 型和DM130 型大孔樹脂來進(jìn)行靜態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)。根據(jù)影響樹脂純化的因素，本論文還對(duì)洗脫的濃度，洗脫劑的用量，上樣液的濃度等進(jìn)行了考察，確定D101 型大孔樹脂為較佳的吸附樹脂，最佳工藝條件為:洗脫劑為80%乙醇，洗脫劑用量為6 BV，最佳上樣液濃度為500 mg/mL。經(jīng)過處理后川陳皮素和橘皮素的純度分別提高了3.7 倍和3.2 倍。

本實(shí)驗(yàn)操作簡單，實(shí)驗(yàn)成本較低，經(jīng)濟(jì)環(huán)保且能達(dá)到較好的分離純化效果，能用于陳皮中多甲氧基黃酮類化合物的分離純化。

1 Zheng GD(鄭國棟)，Jiang L (蔣林)，Yang X (楊雪)，et al.Study on the contents of flavonoids inCitrus reticulata‘Chachi’storaged in different years.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2010，32:977-980.

2 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，57.

3 Song JL(宋家玲)，Yang YJ(楊永建)，Li Q(李強(qiáng))，et al.Advances on research of polymethoxylated flavones.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2012，18:308-313.

4 Wang L(王磊)，Su XS (蘇學(xué)素)，F(xiàn)u CM(付陳梅)，et al.Research progress on biological activities and applications of polymethoxy flavonoids fromCitrus.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:285-290.

5 Li SM，Pan MH，Lo CY，et al.Chemistry and health effects of polymethoxyfiavones and hydrxylated polymethoxyflavones.J Functional Foods，2009，1:2-12.

6 Liu BF(劉邦夫)，Wang HX(王輝憲)，Cao YB(曹永兵)，et al.Study on separation and purification of flavonoids fromcitrus.Che Res App(化學(xué)研究與應(yīng)用)，2008，20:485-489.

7 Chen FS(陳復(fù)生)，Zuo JJ(左錦靜)，YaoYZ(姚永志).Study on the performance of absorption and separation of macroporous res ins for the flavonoids fromcitrus.Food Sci Tech(食品科技)，2006，7:121-124.

8 Zheng GD(鄭國棟)，Jiang L(蔣林)，Yang DB(楊得坡)，et al.HPLC simultaneous determination of contents of five flavonoids inCitrus reticulata‘Chachi’from various habitats.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:652-655.

9 Li LW(林樂維)，Jiang L(蔣林)，Zheng GD(鄭國棟).Study on the contents of flavonoids inCitrus reticulata‘Chachi’from various habitats and different collecting periods.J Chin Med Mater(中藥材)，2010，33:173-176.

10 Wu ZC (吳志成)，Liu SZ(劉淑芝)，Li ML(李曼玲)，et al.Study on refine techincs of fufang jingzhigguanxin with macroporous resin.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2011，17(8):11-14.