VHL基因對U251膠質瘤細胞侵襲和遷移的影響*

肖 兵 葉敏華 周 旋 吳淼經(jīng) 韓 磊 康春生 祝新根

膠質瘤是人類最常見的顱腦腫瘤，其惡性程度高，40%膠質母細胞瘤患者生存期不超過1年［1］。因此，研究膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找膠質瘤治療的新策略和靶點，成為膠質瘤研究領域的一項重要內容。VHL（Von Hippel Lindau）基因作為一種抑癌基因［2］，由Hippel等［3-4］最先發(fā)現(xiàn)，與膠質瘤惡性程度密切相關［5-6］。基質金屬蛋白酶（MMPs）與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關，其中MMP-2、MMP-9成為腫瘤侵襲機制研究的熱點［7］。本研究通過VHL表達質粒轉染膠質瘤細胞，上調VHL基因的表達，觀測其對U251膠質瘤細胞侵襲和遷移能力的影響，探討將VHL作為膠質瘤基因治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

U251膠質瘤細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，VHL表達質粒為本室保存。Transwell小室購自美國Corning公司；DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，VHL mRNA引物購自中國Genepharma公司，GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記、山羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶標記購自中國中杉金橋公司，VHL抗體購自英國Abcam公司，MMP-2、MMP-9抗體購自中國SAB公司，RNA提取試劑Trizol、Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) U251膠質瘤細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃5%CO2的條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 VHL表達質粒轉染U251膠質瘤細胞 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將VHL表達質粒轉染入U251膠質瘤細胞，設為空白對照組和轉染空載體組，培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.2.3 RT-PCR檢測VHL mRNA表達水平 提取經(jīng)轉染孵育24 h后細胞總RNA。引物由上海吉瑪公司合成，RT-PCR法檢測VHL mRNA基因的表達水平。與空白對照組和轉染空載體組進行比較。

1.2.4 Western blot檢測相關蛋白 提取經(jīng)VHL表達質粒轉染孵育24 h后細胞總蛋白，離心后取上清電泳，完畢后將樣品轉移至PVDF膜上（膜須甲醇激活），封閉1 h，分別加入VHL、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗（1∶1 000），4℃過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學發(fā)光法（ECL）曝光定影。

1.2.5 Transwell體外侵襲實驗 將Matrigel過夜解凍，稀釋后的Matrigel涂于細胞生長面。將饑餓12～24 h后的U251膠質瘤細胞制成細胞懸液，用含0.1%FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調至5×105/cm2。取200 μL細胞懸液加入Transwell上室，含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL加入下室。培養(yǎng)48 h后，擦去Matrigel和上室內細胞，多聚甲醛固定10 min；0.1%結晶紫室溫染色10 min，清水漂洗3遍。Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 分別將轉染VHL質粒組、空白對照組、轉染空載體組細胞接種于6孔板中，待其貼壁之后用200 μL槍頭垂直于6孔板底部劃痕，加入培養(yǎng)基后用倒置相差顯微鏡記錄此時及48 h后細胞的遷移情況。

1.2.7 顱內模型的建立及標本制作 取4～6周齡雌性裸小鼠（本實驗經(jīng)倫理委員會審查批準），取對數(shù)生長期U251細胞（用作對照組）及經(jīng)VHL表達質粒轉染后U251細胞常規(guī)消化后制成單細胞懸液，小鼠常規(guī)腹腔麻醉后消毒備皮，將制成的單細胞懸液利用立體定向儀接種于鼠腦右側尾狀核頭部，縫合切口，動物蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。細胞接種后第14天將小鼠斷頭取腦組織，制成切片。

1.2.8 免疫組織化學染色 切片60℃烘烤1 h后常規(guī)脫蠟，熱修復法行抗原修復，室溫冷卻后PBS緩沖液洗3次，1%BSA室溫封閉，滴加VHL、MMP-2、MMP-9一抗4℃過夜，復溫1 h，PBS洗后滴加二抗，37℃孵育30～40 min，PBS洗后滴加三抗，37℃孵育40～60 min，洗后DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸分化返藍后梯度脫水，透明封片，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包處理實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測結果

經(jīng)VHL表達質粒轉染U251膠質瘤細胞后，與空白對照組和轉染空載體組比較，VHL mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1）。

2.2 Western blot分析結果

Western blot結果表明，U251膠質瘤細胞轉染VHL表達質粒組中，VHL蛋白的表達較空白對照組和轉染空載體組明顯升高；MMP-2的表達較空白對照組和轉染空載體組明顯降低；MMP-9的表達較空白對照組和轉染空載體組明顯降低（圖2）。

圖1 轉染VHL表達質粒后U251細胞中VHL mRNA表達水平Figure 1 Expression of VHL mRNA in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

2.3 Transwell體外侵襲實驗結果

觀察48 h后，U251膠質瘤細胞組中空白對照組和轉染空載體組平均視野侵襲細胞數(shù)為（58.88±3.93）、（57.63±2.92）個，而轉染VHL表達質粒后平均視野侵襲細胞數(shù)為（18.81±2.22）個，與空白對照組和轉染空載體組比較侵襲能力明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

2.4 劃痕實驗結果

觀察48 h后，計算遷移至劃痕區(qū)檢測視野內的U251細胞總數(shù)，空白對照組和轉染空載體組分別為（135.20±6.20）個和（127.60±5.53）個，而VHL表達質粒組則為（34.80±5.29）個，與空白對照組和轉染空載體比較遷移細胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖4）。

2.5 免疫組織化學染色結果

VHL、MMP-2、MMP-9陽性信號均定位于細胞質，呈棕褐色染色，發(fā)現(xiàn)VHL表達質粒處理組中VHL的表達較對照組明顯升高，MMP-2、MMP-9的表達較對照組明顯減少（圖5）。再次驗證VHL表達水平上升后MMP-2、MMP-9表達降低。

圖2 轉染VHL表達質粒后U251細胞中相關蛋白表達Figure 2 Expression of related protein in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

圖3 U251細胞轉染VHL表達質粒48 h后Transwell實驗結果（×1 000）Figure 3 Results of Transwell experiment 48 h after the transfection of U251 cells by VHL expression plasmid （×1 000）

圖4 U251細胞轉染VHL表達質粒48 h后劃痕實驗結果（×200）Figure 4 Results of wound-healing experiment 48 h after transfection of U251 cells by VHL expression plasmid（×200）

圖5 不同處理后顱內模型制成的組織切片中VHL、MMP-2、MMP-9表達（×200）Figure 5 The expression of VHL，MMP-2 and MMP-9 in tissue sections from intracranial models with different treatments（×200）

3 討論

膠質瘤惡性程度高，預后較差［8］，以手術治療為主，但由于腫瘤浸潤性生長，與腦組織間無明顯邊界，整體療效仍不理想。隨著對膠質瘤發(fā)病機制逐漸深入研究，出現(xiàn)了越來越多的基因治療，如抗血管生成治療［9］、乏氧腫瘤靶向治療［10］、RNA干擾治療［11］等，均取得一定的療效。

VHL基因定位于3p25～26區(qū)［12］，編碼213個氨基酸的蛋白質，稱為VHL蛋白，是一種重要的腫瘤抑制基因［13-14］，腫瘤發(fā)生與VHL基因突變相關，參與多種腫瘤的發(fā)生，如腎細胞癌、胰腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤、嗜鉻細胞瘤等［2］，VHL與膠質瘤的關系主要為VHL可通過參與HIF-1α泛素化降解的過程［15-16］影響VEGF（vascular endothelial growth factor）的表達，而VEGF是膠質瘤發(fā)生發(fā)展中最為重要的血管形成因子［17］。VHL除了調節(jié)HIF-α水平和抗血管生成外，還具有調節(jié)細胞周期［18］、細胞凋亡［19］、細胞外基質的作用［20］。孫學英等［21］在抑癌基因VHL治療實體腫瘤的實驗研究中利用脂質體法向小鼠實體腫瘤中注射pcDNA3-VHL基因，能顯著抑制實體腫瘤的生長；Chen等［22］將正常的VHL基因轉入不表達VHL蛋白的腎癌細胞中，能明顯抑制腫瘤細胞的生長。表明VHL可作為膠質瘤基因治療中一個有效的靶點。

綜上所述，本研究利用VHL表達質粒轉染U251膠質瘤細胞，上調VHL基因表達，MMP-2、MMP-9表達顯著降低，有效降低U251膠質瘤細胞侵襲和遷移能力，為以VHL為靶點的腫瘤基因治療奠定了基礎。

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