均勻設計法優選桑葉總黃酮提取工藝的研究

李秀英，黃文華，陳 文

（江西中醫藥高等專科學校，江西 撫州 344000）

桑葉為桑科植物桑的葉，于霜降后9月至10月間采收，除去雜質后曬干可藥用。《神農本草經》記載：本品味苦、甘，性寒，歸肺、肝經；功能為疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目；主治風熱感冒、頭昏頭痛、目赤昏花等[1]。現代藥理研究證實，桑葉中的黃酮類成分具有抑制血清脂質增加和抑制動脈粥樣硬化形成的作用[2]。因此，研究和探討桑葉中黃酮類成分的提取工藝對利用桑葉具有重要意義。筆者通過均勻設計，優選出合理的桑葉總黃酮提取工藝，旨在為生產工藝參數的選擇提供理論數據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SYC智能型超級恒溫水浴鍋 （上海普渡生化科技有限公司），FA-B型萬分之一天平（上海精密儀器儀表有限公司），EU-2800DA雙波長紫外可見分光光度計（上海昂拉儀器有限公司），RE-2000B旋轉蒸發儀（上海科升儀器有限公司）。

1.2 試劑

所用試劑甲醇、無水乙醇、冰醋酸、亞硝酸鈉等均為分析純，蘆丁標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200809）。

1.3 材料

桑葉藥材于2014年4月購自樟樹藥材市場，經筆者鑒定為桑科植物桑的干燥葉片，粉碎過40目篩備用。

2 方法與結果

2.1 桑葉總黃酮含量測定[3]

2.1.1 供試品溶液制備 精確稱取過40目篩的桑葉藥材3份，每份5.0g，加50mL乙醇，采用熱回流法提取。每份平行提取兩次，過濾，合并濾液，定容至100mL即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精確稱取在110℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.3mg，置于50mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲使其溶解，定容至50mL，搖勻。精密量取20mL置于50mL容量瓶中，加水定容至50mL即得。

2.1.3 測定波長確定 精密量取對照品溶液3mL和供試品溶液2mL，分別置于25mL刻度的試管中，各加水至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置8分鐘；加10%硝酸鋁溶液1mL，放置8分鐘；加氫氧化鈉試液15mL，加水至刻度，搖勻，放置15分鐘；用相應的試劑作為空白對照，在300～600nm波長范圍內進行掃描。對照品和供試品溶液在415nm處有最大吸收，且光譜形狀極為相似，形成的絡合物在常溫下穩定性好，滿足分光光度法測定的基本要求。因此，選定415nm作為測定波長。

2.1.4 標準曲線繪制 精密量取對照品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，分別置于25mL刻度試管中，加水至6.0mL（6.0ml的對照品溶液中不加水），加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置8分鐘；加10%硝酸鋁溶液1.0mL，放置6分鐘；加氫氧化鈉試液15mL，加水至25mL，搖勻，放置15分鐘；用相應的試劑作為空白對照，在415nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，并得到回歸方程為：Y=11.31X+0.023，R=0.999。對照品蘆丁的濃度在0.0026～0.0128mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.1.5 桑葉總黃酮的測定 精密量取桑葉提取液2.0mL，置于5mL容量瓶中，用相應的試劑作為空白對照，按照2.1.4描述的方法加入試劑，測定吸光度，并計算總黃酮含量。

2.2 方法學研究

2.2.1 精密度試驗 精密量取同一供試品溶液1.0mL，按2.1.4項操作，平行測定5次，RSD（相對標準偏差）為0.89%，表明該方法精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 取同一供試品溶液5份，每份精密量取1.0mL，按2.1.4項操作，測定，RSD為0.51%，表明該方法重現性良好。

2.2.3 穩定性試驗 在室溫下，精密量取同一供試品溶液1.0mL，在0小時、1.0小時、2.0小時、3.0小時、4.0小時分別測定吸光度，分別為0.357、0.359、0.356、0.358、0.358，計算其RSD為0.20%，說明供試品溶液在4小時內穩定。

2.2.4 回收率試驗 精密量取已知總黃酮含量的同一供試品溶液0.5mL，取5份，分別精密加入對照品溶液適量，按2.1.3項操作測定吸光度，得出總黃酮含量，計算出加樣回收率。結果顯示，平均回收率為97.4%，RSD為1.0%，表明該法回收率良好。

2.3 均勻試驗設計及結果

2.3.1 因素水平及指標的確定 采用乙醇回流法提取桑葉總黃酮，主要影響因素為乙醇濃度（%）、料液比（g：ml）、提取溫度（℃）、提取時間（小時）4個因素。因此，以上述4個因素設置7個參考水平，以總黃酮含量為評價指標，用U9（64）均勻設計表安排試驗[4]，優選最佳提取條件。各因素水平見表1。

表1 因素水平

2.3.2 均勻設計結果及分析 按2.1.1項方法制備供試品溶液，按1～6號參數分別精密量取0.5mL，按2.1.4項操作測定各因素水平下的吸光度。采用SAS軟件的非線性回歸法進行擬合[5]，根據擬合結果的決定系數（R2）和模型顯著性檢驗P值，調整模型擬合的參數，最后確定擬合的模型為Y=0.921+0.014 3A+0.0632B+0.0890C+0.0241D，復相關系數R2=0.9971，F=10.53，P<0.05。從決定系數和模型檢驗結果看，模型是可信的。通過方差分析各項對回歸的貢獻：A>B>D>C，且最佳提取工藝為A6B4C6D4，即乙醇濃度為75%、料液比為1:20（g：mL）、提取溫度為80℃、提取時間為2小時。

2.3.3 驗證試驗結果 根據優化工藝，制備3批樣品，測定其中總黃酮的含量，得平均值Y=1.57%，與理論推測值相近，在其范圍區間內，具體結果見表2。

表2 驗證試驗結果

3 討論

通過對均勻設計試驗結果的分析，確定提取溶媒（乙醇）的濃度為影響桑葉總黃酮提取率的主要因素，且影響顯著，料液比次之，而提取時間和提取溫度對桑葉總黃酮提取率的影響較前兩者影響相對小。綜合優選，最后確定最佳提取工藝為料液比1：20（g：mL），乙醇濃度75%，提取時間2小時，提取溫度為80℃。通過該方法優選出的提取工藝簡單、穩定、可行，可用于工廠化推廣。

[1]高中松，丁文，高亮.超聲波提取桑葉中總黃酮的工藝研究[J].中國農學通報，2006，22（4）：116-117.

[2]原愛紅，黃哲，馬駿，等.桑葉黃酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草藥，2004，35（11）：52-56.

[3]祝波，王亞紅.正交優化超聲波法提取瓦松總黃酮工藝的研究[J].中成藥，2012，34（12）：2426-2427.

[4]高毅，高尚.均勻設計優化方法[J].科學技術與工程，2011，11（2）：1671-1672.

[5]周仁郁.SPSS13.0 統計軟件[M].成都：西南交通大學出版社，2005.