局部應用水蛭素對大鼠血管吻合模型術后血栓形成的觀測

胡 哲，張 靜，郭鵬年

（1.包頭醫學院職業技術學院，內蒙古 包頭 014030；2.包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014010）

血管顯微外科成功的關鍵在于顯微血管吻合口通暢，吻合口局部血栓形成是導致通暢率低的主要原因之一[1-2]。目前臨床上常用的防治微血管吻合術后血栓形成的藥物有西藥中的肝素、低分子右旋糖酐、阿司匹林、潘生丁等，中藥中的丹參[3]、川芎[4]、水蛭[5]等。

潘浩等[6]認為水蛭具有減少兔的股動靜脈吻合口血栓形成，提高遠期通暢率的作用。但水蛭療法可能出現貧血、感染、敗血癥等嚴重并發癥，靜脈應用水蛭素可能出現出血、過敏、致死等問題，且水蛭素的用量、用法、凝血指標檢測等依然不確定。基于以上問題，本研究制作了血管吻合模型，分別局部應用生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液）、肝素溶液（62.5U/ml）、水蛭素溶液（1ATU/ml），并通過觀察不同時間點吻合血管的通暢率、吻合口組織形態學變化，評估血栓面積等方法來探討局部應用水蛭素對微血管吻合術后血栓形成的影響，為水蛭素應用于顯微外科血管吻合術提供實驗依據，從而為臨床提高顯微血管吻合口通暢率提供藥物支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠120只，均為雌性，體重200～240g，平均（210±11）g，從內蒙古醫科大學動物實驗中心購入。在包頭醫學院第一附屬醫院動物實驗室飼養（室溫約22℃～24℃，每天喂食2～3次，自由飲水）。

1.2 動物模型制作

將Wistar大鼠統一編號，按完全隨機分組方法分為生理鹽水組、肝素組、水蛭素組，每組40只。全部用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，備皮后碘伏消毒手術野皮膚，在股內側做一縱行切口（起自腹股溝韌帶中點，至股骨中下段），逐層分離組織，并游離出股動脈，暴露長度2cm，用兩個微血管夾（遠近端相距1cm）阻斷股動脈，然后于中點處橫行切斷，修剪外膜。接著，生理鹽水組用0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：D11081304，規格：500ml/瓶）、肝素組用62.5 U/ml肝素溶液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號：1006108，規格2ml:12500單位/安瓿）、水蛭素組用1ATU/ml水蛭素溶液（廣西科康生物科技有限責任公司，批號：20110312，規格：30ATU/瓶）沖洗血管腔。再全部用11-0尼龍線做原位斷端縫合，吻合進針時保證針尖與血管壁以垂直角度進入，邊距、針距均勻一致，內膜對合良好，一般前、后壁各3針，共6針，每針縫線打3道結。每個吻合口在吻合最后一針未打結之前，用注射器針頭向吻合口內注入相應溶液（生理鹽水組：0.9%氯化鈉注射液，肝素組：62.5U/ml肝素溶液，水蛭素組：1ATU/ml水蛭素溶液）至吻合口充盈為止，然后完成打結。吻合完成后，再向吻合斷端局部注射3ml相應溶液（同上），觀察血管通血情況，血管通暢實驗確認吻合成功。用1號慕絲線關閉傷口，同法處理另一側股動脈。手術完畢后，將大鼠置于單籠飼養，自由活動。保持飼養室溫度為23℃。

1.3 觀察血管通暢情況

分別于術后2小時、24小時、3天、5天4個時間點從每個實驗組取10只大鼠，打開切口，顯露吻合后的血管（每組每個時間點兩側股動脈共20條血管），觀察血管吻合后的通暢情況。

1.4 組織學觀察及圖像分析

于術后4個時間點行大體觀察后將吻合血管段取出（長約1cm），經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續5μm切片，HE染色，脫水，封片。在光學顯微鏡下觀察組織形態，取相當于血管血栓體部中點的切片，用ImageProPlus6.0醫學圖像處理系統測量血栓比值。

1.5 統計學處理

結果以（±s）表示，3組間通暢率比較用行×列表χ2檢驗，3組間血栓比值比較用F檢驗和q檢驗。

2 結果

2.1 大體觀察及血管通暢率

術后2小時，血管與周圍組織無粘連，吻合口有輕度水腫，無血塊黏附于血管壁，血管腔無狹窄，吻合血管通暢率均為100%，3組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 術后2 小時3 組間血管通暢情況比較

術后24小時，血管與周圍組織發生輕度粘連，大部分吻合口通暢，吻合口處外壁稍隆起，血管無狹窄。部分血管吻合口附近壁內可見血凝塊，遠端血流量小，流速慢，血管通暢實驗呈弱陽性，遠端血管變細。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表2。

表2 術后24 小時3 組間血管通暢情況比較

術后3天，血管內無血塊，栓塞血管可見血凝塊附著壁內，遠端血管內無血液流動，血管通暢實驗呈陽性，血管蒼白。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表3。

表3 術后3 天3 組間血管通暢情況比較

術后5天，血管粘連加重，不易游離。縫線部分可見，栓塞血管可見血凝塊附著壁內，血管通暢實驗呈陽性，管腔變細。生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血管通暢率進行兩兩比較，無顯著性差異（P>0.05），見表4。

表4 術后5 天3 組間血管通暢情況比較

2.2 組織學觀察及圖像分析

可見內皮細胞損傷性改變，內皮細胞腫脹、部分脫落，中膜層平滑肌細胞變性壞死，外膜纖維組織增生及炎性細胞浸潤，中性白細胞浸潤隨時間延長呈減弱趨勢。

各組血栓吻合口內可見血栓形成，內皮細胞部分脫落，中層纖維組織增生，各組間在組織上的病變差別不大（P＞0.05）。

術后2小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%，肝素組和水蛭素組血栓比值低于生理鹽水組（P<0.05），肝素組和水蛭素組之間比較，無顯著性差異（P>0.05）。

術后24小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%，經統計學分析，肝素組、水蛭素組、生理鹽水組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01）。

術后3天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%，經統計學分析，生理鹽水組、肝素組和水蛭素組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01）。

術后5天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%，經統計學分析，生理鹽水組、肝素組和水蛭素組血栓比值3組間兩兩比較，有顯著性差異（P<0.01），見表5。

表5 術后不同時間3 組間血栓比值（±s，%）

表5 術后不同時間3 組間血栓比值（±s，%）

注：與生理鹽水組比較，▲P＜0．05；與生理鹽水組比較，★P＜0．01；與肝素組比較，■P＜0．01

2小時血栓比值24小時血栓比值3天血栓比值5天血栓比值生理鹽水組 肝素組 水蛭素組3.32±1.16 8.21±1.55 11.27±3.21 13.47±2.91 1.22±0.87▲3.51±1.08★■4.56±1.88★■6.35±1.78★■1.13±0.75▲5.23±1.28★7.13±2.14★9.34±2.04★

3 討論

3.1 運用水蛭素的臨床意義

人類應用水蛭治療疾病可以追溯到距今3500多年前[7-10]。水蛭入藥在我國最早記載于東漢時期的藥物學專著《神農本草經》，至今也有2000多年的歷史。我國中醫認為水蛭具有破血逐淤通經的功效，主要用于治療血瘀經閉、癥瘕痞塊、跌打損傷。薛鳳等[11]將單味中藥水蛭制成粉狀，口服治療高黏血癥患者30例，其血脂、血黏度、血小板的降低及臨床癥狀的改善均優于阿司匹林組（P＜0.05）。

3.2 血管吻合后通暢率的比較

3組血管吻合后通暢率均隨著時間延長逐漸下降。術后2小時，3組通暢率均為100%；術后24小時，生理鹽水組為85%，肝素組為90%，水蛭素組為95%；術后3天，生理鹽水組為80%，肝素組為90%，水蛭素組為90%；術后5天，生理鹽水組為80%，肝素組為85%，水蛭素組為90%。這與血栓形成的規律較為符合。術后24小時、3天、5天，肝素組和水蛭素組通暢率均高于生理鹽水組，但進行統計學分析后，顯示3組間血管的通暢率比較，無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于每組每個時間點的實驗樣本量較小（20條血管）的原因造成。

3.3 血栓比值

行組織形態學檢查，3組血管血栓比值隨時間延長而逐漸增大。術后2小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（3.32±1.16）%、（1.13±0.75）%、（1.22±0.87）%；術后24小時，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（8.21±1.55）%、（5.23±1.28）%、（3.51±1.08）%；術后3天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（11.27±3.21）%、（7.13±2.14）%、（4.56±1.88）%；術后5天，生理鹽水組、肝素組、水蛭素組血栓比值分別為（13.47±2.91）%、（9.34±2.04）%、（6.35±1.78）%。這一規律與陳鐵軍等[12]的研究結果一致。

綜上所述，在術后2小時、24小時、3天和5天時，肝素組與水蛭素組的血管通暢率比較，無顯著性差異（P＞0.05），但后3個時間點3組間血栓比值兩兩比較，有顯著性差異（P＜0.01）。說明當有少量血栓形成時，可能對血管的通暢率無明顯影響。本研究僅觀察了血管吻合后早期的血管通暢情況，但其遠期效果如何以及能否保持相對的穩定，還有待深入研究。

[1]Wieslaander J B，Aberg M，Dougan P． Accumulation of isotype Labelled platelets in small arteries after end to end and end in end anastomoses in the rabbit[J]． Br J Plast Surg，1982，35（4）：158-159．

[2]Chien W，Varvares M A，Hadlock T，et al． Effects of aspirin and lowdose heparin in head and neck reconstruction using microvascular free flaps[J]．Laryngoscope，2005，115（6）：973-976．

[3]周武雄，鐘慈聲，袁偉，等．血管吻合術后過氧化氫的形成及丹參素對超氧自由基的作用[J]．上海醫科大學學報，1998，25（2）：115-117．

[4]郭君紅．川芎嗪防治家兔微血管吻合術后血栓形成的實驗研究[D]．武漢：湖北中醫學院，2003．

[5]馬進理，潘浩．水蛭防治微血管吻合術后血栓形成的實驗研究[J]．浙江中西醫結合雜志，1999，9（1）：25-26．

[6]潘浩，胡秀慧．水蛭防治微血管吻合口血栓形成的實驗研究[J]．中國中醫骨傷科，1999，7（3）：1-3．

[7]Whitaker I S，Rao J，Izadi D，et al． Historical article : hirudo medicinalis : ancient origins of ，and trends in the use of medicinal leeches throughout history[J]．Br J Oral Maxillofac Surg，2004，42（2）：133-137．

[8]Hyson J M．Leech therapy:a history[J]．J Hist Dent，2005，53（1）：25-27．

[9]Abdelgabar A M，Bhowmick B K．The return of the leech [J]．Int J Clin Pract，2003，57（2）：103-105．

[10]Aslan G，Terzioqlu A，Tuncali D． The reusable medicinal leech[J]．Plast Reconstr Surg，2003，111（3）：1358-1359．

[11]薛鳳，趙圣美．單味中藥水蛭治療高黏血癥30 例[J]．山東醫藥，1997，37（4）：51-52．

[12]陳鐵軍，陳瑞芬，常松，等．家兔股動脈血栓形成模型及其形態學觀察[J]．首都醫學院學報，1991，12（1）：23-26．