同源重組敲除臨床肺炎克雷伯菌質粒blaKPC-2基因

仉 英，田月如，艾芙琪，劉 紅，馬逸珉，王 蓓，蔣曉飛

(復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗科，上海200040)

由于抗菌藥物的濫用，導致臨床菌株的耐藥性不斷增強。最主要的耐藥機制是通過質?；蚱渌梢苿釉@取并不斷積累各種耐藥基因，導致同一菌株攜帶多種耐藥基因而產(chǎn)生多重耐藥、泛耐藥。我們研究小組通過研究2006年8月至2009年12月共57株泛耐藥臨床肺炎克雷伯菌株，發(fā)現(xiàn)其主要為2種多位點序列分析(multilocus sequence typing，MLST)型別:ST423型(HS062105)和ST11型(HS082416)，所有菌株都攜帶 KPC-2、CTXM-14和 SHV-12型 β-內酰胺酶基因。為研究泛耐藥臨床肺炎克雷伯菌積累多種β-內酰胺酶基因的原因，以及每種耐藥酶在耐藥機制中所起的作用和其相互之間的作用，將這些基因從臨床菌株中逐一敲出，并逐一回補到肺炎克雷伯菌標準菌株中，這種快速、高效的研究方法目前尚未見報道。本研究小組成功地運用λ red同源重組法敲除了一株ST423型(HS062105)和一株ST11型(HS082416)肺炎克雷伯菌臨床菌株質粒上的KPC基因。

材料和方法

一、菌株和質粒

肺炎克雷伯菌HS062105(ST423型)來自華山醫(yī)院2006年8月從尿標本中分離到的臨床菌株，肺炎克雷伯菌HS082416(ST11型)于2009年10月從痰標本中分離。質粒 pKOBEG-Apr、pMQ300來自于英國Leicester大學實驗室。

二、主要儀器和試劑

Bio-tech公司生產(chǎn)的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀、電導入儀、離心機，抗菌藥物氨芐西林(ampicillin，AMP)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)、亞胺培南(imipenem，IMP)、美羅培南(meropenem，MEM)和厄他培南(ertapenem，ETM)購自中國藥品生物制品檢定所，血瓊脂平板購自上海科瑪嘉生物有限公司，菌株的分離與鑒定使用法國生物梅里埃公司全自動微生物分析系統(tǒng)VITEK-Compect，PCR試劑購自大連寶生物TaKaRa公司。引物合成由上海英駿生物有限公司完成，電泳結果分析使用Tanon2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)。

三、同源重組片段的制備和純化

以試驗臨床菌株質粒為模板，SOE1、SOE2和SOE5、SOE6為引物，質粒pMQ300為模板，SOE3、SOE4為引物，分別進行PCR擴增，見表1，得到PCR產(chǎn)物TS1、TS2和hph，然后以PCR產(chǎn)物TS1及hph為模板，SOE1、SOE4為引物進行重疊延伸基因擴增(gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR)，得到產(chǎn)物TS1-hph，再以 TS1-hph為模板，以 SOE1、SOE6為引物進行SOE-PCR即可得到產(chǎn)物TS1-hph-TS2。經(jīng)鑒定的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收純化并測定DNA濃度，試驗過程見圖1[1-3]。

表1 試驗引物

圖1 λ red同源重組片段的構建示意圖

四、λ red重組功能的誘導

1.λ red依托質粒pKOBEG-Apr電轉化進入試驗菌株 試驗菌株制備成為感受態(tài)，取0.1 μg pKOBEG-APr質粒DNA電擊轉化感受態(tài)細胞，電轉后加入1 mL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60 min之后涂于含阿普霉素的LB平板上，30℃過夜。30℃過夜LB平板上生長的單克隆即為含有λ red依托質粒pKOBEG-Apr的試驗菌株。

2.λ red重組蛋白的誘導 挑取30℃過夜LB平板上的單克隆，加入5 mL LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，次日以1∶50的比例接種細菌至100 mL LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至吸光度(A)600值為0.2時，加入L-阿拉伯多糖至終濃度為0.1%，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)至A600值為0.6，在此期間exo/bet/gam蛋白在L-阿拉伯多糖的誘導下發(fā)生了短暫表達，將誘導表達后的細菌制備成為感受態(tài)。

五、λ red重組

取0.2 μg帶有同源臂的融合片段(步驟3)電擊轉化感受態(tài)細胞(步驟5)，電轉后加入1 mL LB培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)60 min，最后取其中的100μL 涂于潮霉素(150 μg/mL)+ 阿普霉素(10 μg/mL)LB平板上，30℃過夜。30℃過夜LB平板上生長的單克隆同時含有λ red依托質粒pKOBEG-Apr和帶有同源臂的融合PCR產(chǎn)物，在λ red重組蛋白的誘導下，同源重組敲除試驗菌株的blaKPC-2基因。

六、重組后鑒定

挑取數(shù)個單克隆至2 mL LB培養(yǎng)基中[潮霉素(150 μg/mL)+ 阿普霉素(10 μg/mL)]，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日提取質粒 DNA，PCR擴增blaKPC-2及hph基因。

七、目的基因完全去除的驗證

抽提原試驗菌株及重組后菌株RNA，逆轉錄PCR定量檢測blaKPC-2基因的表達量。

八、抗菌藥物敏感性試驗

參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M07-A8，采用微量肉湯最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)法檢測野生株及 blaKPC-2缺陷突變株對 AMP、CTX、CAZ、IMP、MEM 和 ETM 的敏感性。

結 果

一、同源重組片段的構建

耐藥基因片段、上下游片段及融合片段電泳結果見圖2，泳道1～5為ST423型試驗菌株各片段電泳圖，泳道6～10為ST11型試驗菌株各片段電泳圖。

二、重組克隆株的篩選及確認

野生株中blaKPC-2基因為陽性，hph基因為陰性，而blaKPC-2缺陷突變株中blaKPC-2基因為陰性，hph基因為陽性，即可確認blaKPC-2缺陷突變株發(fā)生了同源重組，成功敲除了blaKPC-2基因，見圖3。

圖2 耐藥基因片段、上下游片段及融合片段電泳圖

圖3 原試驗菌株(野生株)和重組克隆株(blaKPC-2缺陷突變株)中blaKPC-2和hph基因電泳圖

三、野生株及blaKPC-2缺陷突變株中blaKPC-2基因的表達水平

使用逆轉錄PCR，以HS08763作為參考菌株，野生株HS062105(ST423型)blaKPC-2基因表達量為參考菌株表達量的1.9倍，野生株HS082416(ST11型)blaKPC-2基因表達量為參考菌株表達量的 0.9倍。blaKPC-2缺陷突變株 ΔHS062105、ΔHS082416 blaKPC-2基因表達量檢測不出，說明成功敲除了野生株blaKPC-2基因。

四、體外藥物敏感性試驗

野生株 HS062105(ST423型)、HS082416(ST11 型)對 AMP、CTX、CAZ、IMP、MEM、ETM均耐藥，blaKPC-2缺陷突變株 ΔHS062105對 IMP、MEM敏感，ΔHS082416對 IMP、MEM、ETM 敏感。見表2。

表2 野生株及blaKPC-2缺陷突變株藥物敏感性試驗結果

討 論

傳統(tǒng)的同源重組敲除某特定基因需要多步亞克隆，費時、費力。λ red重組質粒pKOBEG-Apr攜帶λ red，在L-阿拉伯糖的誘導下可表達同源重組蛋白exo/bet/gam，介導電轉入的線性融合產(chǎn)物與相應的基因發(fā)生同源重組，然后再用合適的抗菌藥物篩選，即可得到重組突變株，省時、省力。由于pKOBEG有一溫度敏感的復制起始位點，當溫度高于37℃時，細菌將消除質粒pKOBEG。不會對細菌后續(xù)研究造成干擾，是一種簡單、高效的敲除方法。

泛耐藥菌株對幾乎所有臨床常用的抗菌藥物都耐藥，很難找到合適的耐藥標記篩選特定的突變克隆株，造成臨床菌株的研究困難，進展緩慢。潮霉素和阿普霉素廣泛應用于農(nóng)業(yè)細菌學研究，未在臨床中使用。臨床菌株普遍對這2種藥物敏感，因此在臨床菌株中非常有用。

本研究選取了2006年8月至2009年12月分離的肺炎克雷伯菌 HS062105(ST423型)、HS082416(ST11型)，在這個時間段內，泛耐藥肺炎克雷伯菌快速播散，臨床分離菌株數(shù)量呈指數(shù)增長，并由ST423型轉變?yōu)槎玖Ω叩腟T11型。研究耐藥基因水平傳播的機制，此時間節(jié)點分離到的泛耐藥肺炎克雷伯菌最具代表性。我們成功地用FKPCU-Hyg-FKPCD片段替換了細菌的KPC基因，克隆證實突變菌株KPC(-)、Hyg(+)，藥物敏感性試驗結果顯示菌株敲除KPC基因后對IMP、MEM和ETM敏感，而菌株HS062105(ST423型)僅對IMP和MEM敏感，ETM仍耐藥。究其原因是HS062105(ST423型)、HS082416(ST11型)還產(chǎn)生CTXM-14及SHV-12，因此對CAZ、CTX等仍耐藥，HS062105(ST423型)對ETM仍耐藥是因為該菌株還產(chǎn)生一種頭孢菌素酶，有文獻報道高表達頭孢菌素酶加上膜孔蛋白缺陷可導致菌株對ETM 耐藥[4]。

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