非小細胞肺癌KAI1基因和TIMP－1、MMP－9表達與臨床生物學行為的關系研究

朱 波，趙惠柳，王 英，勞 明，黃昭東，劉志民，謝 娟，歐 超

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，廣西南寧530021)

肺癌是當今世界上對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。侵襲轉移是肺癌患者死亡的首要原因，是1個極其復雜的多基因調控和多步驟發展的過程，并涉及復雜的基因家族群參與的腫瘤轉移相關基因的改變，相關基因起抑制肺癌轉移或促進轉移的作用[1]。KAI1基因是腫瘤轉移抑制基因[2]，主要影響細胞間及細胞與細胞外基質間的信號傳導。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)在腫瘤的侵襲轉移過程中發揮了重要作用，是目前研究的熱點。我們采用 SuperPicTure免疫組化法檢測 KAI1和TIMP-1、MMP-9在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中的表達，以探討它們對NSCLC生物學行為的影響，并分析臨床病理因素與它們之間的相關性及臨床意義。

材料和方法

一、臨床資料

收集2007年8月至2009年6月廣西醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科手術切除肺癌標本73例(經病理學檢查確診為原發性NSCLC)、相應的癌旁組織[距癌組織 ＞3 cm，經蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色證實無癌細胞浸潤]51例和非腫瘤性肺組織標本13例(肺結核5例、支氣管擴張4例、炎性假瘤4例)。患者年齡19～78歲，中位年齡56.5歲。腺癌32例(高分化19例、低分化13例)，鱗癌41例(高分化19例、中分化16例、低分化6例)，依據1997年國際抗癌聯盟TNM分期標準，Ⅰ期41例、Ⅱ期19例、Ⅲ期13例。所有患者術前均末接受化療、放療及其他抗癌治療。KAI1抗體購自美國Santa Cruz公司，TIMP-1和MMP-9單克隆抗體購自美國Lab-Vision-NeoMarkers公司，二抗 SuperPicTure試劑盒、二氨基聯苯胺顯色劑均為美國Zymed公司產品。

二、方法

所有手術標本用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成厚4 μm的切片，采用免疫組化SuperPicTure法進行 KAI1和 TIMP-1、MMP-9染色。按SuperPicTure試劑盒操作說明進行，主要步驟如下:切片脫蠟至水，高壓修復1.5 min，阻斷內源性過氧化物酶20 min，正常非免疫血清封閉30 min，滴加Ⅰ抗在室溫孵育1 h，滴加50μL酶標抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min;新鮮二氨基聯苯胺-H2O2溶液顯色，蘇木精復染。用已知陽性反應片作陽性對照，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)替代Ⅰ抗進行同步染色。KAI1和TIMP-1、MMP-9工作液濃度分別為 1∶150、1∶50、1∶100。

三、結果判斷

免疫組織化學結果顯示肺癌細胞中KAI1蛋白的陽性著色主要表現為細胞漿和/或細胞膜陽性，呈彌漫性分布，TIMP-1蛋白的陽性著色為細胞漿和胞膜內陽性，MMP-9蛋白的陽性著色為細胞膜陽性。染色結果觀察采用雙盲法，由2位病理科醫生在不知病理分級與臨床資料的情況下讀片，每張切片觀察5個視野(400倍)計算陽性細胞數，計算總細胞數不少于1 000個，按陽性細胞所占百分數分為:陽性細胞率＜5%為陰性(－);5%～24%為弱陽性(+);25%～50%為陽性(++);＞50%為強陽性(+++)。

四、統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行χ2檢驗，相關分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、隨訪

所有病例術后進行常規放療和/或化療，并追蹤隨訪1年。每月采用電話或信訪，術后每隔3個月復查計算機斷層掃描，了解有無復發。73例患者中65例有隨訪資料，其中24例隨訪6個月出現復發，12例隨訪1年死亡。

二、KAI1和TIMP-1、MMP-9的表達情況

KAI1陽性染色定位于細胞漿和/或細胞膜中，陽性細胞染色呈散在或片狀分布，見圖1;73例NSCLC中有29例陽性，陽性率為39.7%;在64例癌旁組織及非腫瘤性肺組織中有58例陽性，陽性率為90.6%。兩者比較差異有統計學意義(P ＜0.05)。

TIMP-1蛋白陽性染色定位于細胞漿和細胞膜內，呈彌漫性分布;MMP-9定位于腫瘤細胞核和細胞漿，棕褐色顆粒狀或團塊狀著色，間質的纖維細胞也呈MMP-9弱陽性，見圖1。

NSCLC中TIMP-1和MMP-9的陽性率分別為74.0%、79.4%，與相應癌旁組織及非腫瘤性肺組織中陽性率(37.5%、67.1%)相比，TIMP-1 在NSCLC的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。NSCLC標本MMP-9蛋白陽性表達率高于癌旁組織，但差異無統計學意義(P ＞0.05)。

圖1 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC組織中的表達(SuperPicTure×400)

三、KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC表達的相關性

在29例KAI1陽性表達的NSCLC組織中18例呈TIMP-1陽性表達，占54例TIMP-1陽性表達的33.3%(18/54);20例呈 MMP-9陽性表達，占58例 MMP-9陽性表達的34.5%(20/58);KAI1與TIMP-1陽性表達密切相關(r=－0.463 7，P=0.002 2)，與MMP-9的陽性表達也密切相關(r=－0.344 5，P=0.027 3)，呈負相關。

四、KAI1和TIMP-1、MMP-9的表達與臨床生物學行為的關系

73例NSCLC患者按年齡、性別、腫瘤類型及分化程度、TNM分期、淋巴結轉移分組。KAI1和TIMP-1、MMP-9在 NSCLC組織中的檢出率與TNM分期、淋巴結轉移明顯相關(P＜0.05)，與年齡、性別無關;KAI1的檢出率與腫瘤類型也明顯相關(P＜0.05)，而TIMP-1和 MMP-9的檢出率與腫瘤類型無明顯關系。見表1。

表1 KAI1和TIMP-1、MMP-9在NSCLC中陽性率與臨床生物學行為的關系 [例(%)]

討 論

肺癌是目前對人類健康與生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近半個世紀以來其發病率和死亡率均呈上升趨勢。影響肺癌患者療效和導致死亡的最主要原因是肺癌的侵襲與轉移[1]。KAI1基因是最近發現的與腫瘤轉移抑制相關的基因，該基因定位于人染色體11p11.2，全長約80 kb，包括10個外顯子與9個內含子[2]。TIMP是一類相對分子質量較低的蛋白酶家族，屬分泌蛋白類，目前已鑒定出4 個成員，即 TIMP-1、2 、3 、4[3]，他們分別定位于人 Xp11.3 ～Xp11.23、17q25、22q12.1 ～q13.2及3p25。MMP屬于鋅肽酶超家族，幾乎可降解細胞外基質的所有成分[4]，TIMP分子結構上存在功能不同的N端和C端，前者是抑制MMP關鍵部位;后者則在蛋白定位以及與MMP前體結合成復合物的過程中起關鍵作用。它們在腫瘤的侵襲轉移過程中發揮了重要作用。目前的研究顯示，KAI1基因的抑制轉移機制較為復雜，多種說法不一。有研究表明KAI1蛋白定位于細胞與細胞交界的細胞膜上，間質成分不表達，提示KAI1參與了細胞間及細胞與胞外基質間的反應[5]。這種反應可能介導了細胞與環境間的信號傳遞，從而影響細胞的運動和分化，影響腫瘤細胞的浸潤和轉移。KAI1基因的低表達與細胞間粘附作用減弱、細胞與胞外基質粘附作用減弱、體內外侵襲能力增強密切相關[6]，但目前有關這些效應的分子機制仍不甚清楚。本研究表明KAI1在NSCLC和癌旁組織及非腫瘤性肺組織中表達率為39.7%和90.6%，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。KAI1在NSCLC中的表達表現為下調，同時與淋巴結轉移、TNM分期有關(P＜0.05)，與年齡、性別無關，提示KAI1基因的高表達具有抑制腫瘤轉移的作用，而一旦無法保持KAI1基因的高表達，則腫瘤進入進展期并開始發生侵襲和轉移，說明KAI1基因可能對NSCLC的浸潤和轉移有抑制作用。本研究發現，NSCLC中TIMP-1、MMP-9 的陽性率分別為 74.0%、79.4%，明顯高于相應癌旁組織及非腫瘤性肺組織的陽性率(37.5%、67.1%)(P ＜ 0.05);而 NSCLC 標本MMP-9蛋白陽性表達率高于癌旁組織，但差異無統計學意義(P＞0.05)。進一步的研究發現TIMP-1、MMP-9在NSCLC中的表達表現為上調，同時與淋巴結轉移、TNM分期有關(P＜0.05)，與年齡、性別無關。TIMP與MMP的相對水平才是其中的決定性因素，兩者間的精細平衡在維系健康組織的完整性、調控腫瘤誘導的血管發生、基底膜降解、炎癥反應及慢性退行性病變這些病理生理過程中都發揮了重要作用[7-8]。因此，這些分子之間的相互作用關系有可能是KAI1具有轉移抑制功能的關鍵原因。

本研究發現KAI1的檢出率與腫瘤類型明顯相關(P＜0.05)，而TIMP-1和 MMP-9的檢出率與腫瘤類型無明顯關系，進一步的研究發現KAI1與TIMP-1、MMP-9在NSCLC表達密切相關(負相關)，這與Jee等[9]在腫瘤細胞系的研究相一致，即將KAI1基因轉染至人NSCLC細胞株H1299中獲取過表達KAI1的轉染細胞株，并對后者的侵襲轉移性及相關分子事件進行研究，發現在轉染細胞株中，MMP-9的mRNA和蛋白表達水平均上升，但酶活性下降。此外，還發現TIMP-1的表達水平亦有上升，認為KAI1可能是通過上調TIMP-1導致MMP-9失活，進而抑制了肺癌細胞株H1299的侵襲轉移潛力。霍小森等[10]研究結果發現KAI1蛋白表達可作為NSCLC預后的指標，對臨床預測NSCLC轉移具有一定指導意義。臨床研究表明，包括肺癌在內，許多晚期轉移性癌癥中都有KAI1基因表達下調或缺失的事件發生[11]。提示KAI1的異常表達與肺癌的浸潤轉移有關，對肺癌的發生、發展有重要預測作用。

總之，KAI1在NSCLC中低表達，相反TIMP-1、MMP-9在NSCLC中高表達，三者不同程度地與淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤類型有關，KAI1與TIMP-1、MMP-9之間存在負相關關系，提示KAI1可能通過上調TIMP-1、MMP-9的表達促進肺癌的發展。說明三者與肺癌的發展有關，可成為評價預后的參考指標，聯合檢測三者對判斷肺癌的組織分化、惡性程度有指導意義。

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