叢枝菌根真菌對白三葉根系構型和糖含量的影響

吳強盛，袁芳英，2，費永俊，李莉，黃詠明，劉春艷

(1.長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025;2.京山縣農業局，湖北 荊門431800)

根系構型指同一根系中不同類型的根(直根系)或不定根(須根系)在生長介質中的空間造型和分布［1］。根系構型的優劣直接影響植物對土壤養分和水分的吸收，進而影響植物的形態構建。根系構型最顯著的特點是具有可塑性，受諸多因素的影響，如微生物等［2-4］。目前對根系構型的影響因素研究主要關注生長介質的營養狀況以及植物基因型，關于土壤中的微生物對植物根系構型影響的研究甚少。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AM真菌)作為土壤中的一類有益微生物，能夠與大多數植物根系建立叢枝菌根共生體，其在根外建立的菌絲網絡已經顯示了許多有益的功能，如促進寄主植物養分和水分的吸收，改善寄主植物生長，增強寄主植物的抗逆性，增強草坪植物［如狗牙根(Cynodon dactylon)］刈割后再生能力等［5-6］。已有研究結果表明，在葡萄(Vitis vinifera)上接種AM真菌聚生球囊霉(Glomus fasciculatum)顯著提高其二級側根和三級側根的數量［7］。然而，接種珠狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita)和地表球囊霉(G.versiforme)對枳實生苗根系的總長度、投影面積、表面積、平均直徑、體積等沒有顯著影響，摩西球囊霉(G.mosseae)和蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)接種還顯著降低了根系總長度、面積和體積［8］。因此，進一步通過不同AM真菌種類來驗證其在根系構型上的效應顯得十分必要。另一方面，根系的生長發育需要碳水化合物作為能量來源或者反應底物，即植物體內糖含量變化會影響根系構型的優劣［9］。而AM真菌也需要消耗4% ～20%的寄主植物光合碳水化合物以維持自身的生長發育［10］。在這個過程中，AM主要吸收根系的葡萄糖，而不是蔗糖［11］。而根系的碳水化合物主要依賴葉片的蔗糖經過韌皮部下運。在AM存在條件下植物葉片和根系蔗糖和葡萄糖含量有何變化，目前還不清楚。此外，在接種AM真菌條件下，植物蔗糖和葡萄糖的根系分配率與植物根系構型有正的相關關系［12］。因此，進一步明確根系構型－AM－碳水化合物三者間的關系，對明白菌根改變根系構型至關重要。

白三葉(Trifolium repens)作為我國廣泛栽培的牧草之一，具有產量高以及再生速度快、匍匐生長等特點，也成為綠地定植的草種之一［13］。在白三葉根際存在許多的有益微生物，如植物根際促生菌、AM真菌等［14］。本研究以白三葉為寄主植物，通過接種不同AM真菌對植株生長、根系構型、葉綠素和組織糖含量的變化，探討AM真菌對植物根系構型的效應及這種效應發生的可能機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為白三葉。供試AM真菌為粘屑多樣孢囊霉(Diversispora spurca)、地表球囊霉(Glomus versiforme)和隱類球囊霉(Paraglomus occultum)，由北京市農林科學院植物營養與資源研究所“叢枝菌根真菌種質資源庫”(BGC)提供，菌根接種體的形式是感染的高粱(Sorghum vulgare)根段、菌絲、孢子和沸沙的混合物。試驗用盆為塑料盆，規格是:上口徑16 cm、下內徑11 cm、盆高13 cm。盆里預先裝有高壓蒸氣滅菌(121℃，0.11 MPa，2 h)的黃棕壤與蛭石按照1∶1(體積比)混合基質，2010年10月19日進行播種，播種前預先對種子采用70%酒精表面消毒5 min，蒸餾水沖洗3次后，點播于塑料盆基質表層0.5 cm處，每盆點播35粒種子，5 d后保留至30株/盆。所有的試驗盆置于PQX人工氣候箱培養，25℃白天/18℃晚上，16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗設計

試驗共設4個處理，包括接種粘屑多樣孢囊霉、地表球囊霉、隱類球囊霉和不接種叢枝菌根真菌(non-AMF)的對照。接種AM真菌處理的每盆15 g菌劑。每個處理重復3次，每盆30株白三葉，共12盆，隨機排列。

1.3 測定方法

在培養箱中經過85 d生長后結束實驗，收獲各個處理的葉片、根系，仔細地將根系從栽培基質中取出，盡可能不傷害根系，用自來水洗凈后，采用EPSON平板掃描儀采集完整的根系圖片，然后對圖片用WinRHIZO根系分析軟件分析根系構型參數，包括長度、投影面積、表面積、體積、平均直徑、根尖數、分支數和交叉數。每盆30株三葉草根系均用于根系掃描，30株的根系構型參數平均值作為1次重復。

從每個處理中隨機選取15株，于70℃下烘干48 h，然后測定地上部和地下部干重。剩余每盆15株的葉片混合，采用80%丙酮提取，于646和663 nm下比色測定葉綠素含量［15］;部分根系剪成1 cm左右的根段，菌根的染色依次經過10%KOH 在90℃透明30 min，10%H2O2漂白10 min，0.2 mol/L HCl酸化10 min，0.05%曲利苯藍染色10 min［5］，菌根侵染率用菌根侵染的根段長度占檢查根段的總長度的百分數表示。

蔗糖和葡萄糖含量采用比色法［16］進行。取50 mg過篩(1 mm)干樣，加入4 mL 80%酒精在80℃水浴40 min，2500 r/min收集上清液，殘渣加4 mL 80%酒精重復提取1次，合并上清液，其中葉片提取液加入10 mg活性炭于80℃水浴脫色30 min，過濾。等量的酒精提取液與2 mol/L NaOH混合，沸水浴5 min，冷卻，加入30%HCl和0.1%間苯二酚，搖勻，80℃水浴10 min，冷卻后480 nm處比色測定蔗糖含量。取1 mL酶制劑(鄰聯茴香鹽酸鹽、辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶混合物，pH 5.5)，加入0.5 mL酒精提取液，30℃保溫5 min，然后加入2 mL 10 mol/L H2SO4，于460 nm處比色測定葡萄糖含量。

1.4 統計分析

運用SAS 8.1軟件的ANOVA過程對處理間作差異性測驗，LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同AM真菌對白三葉菌根侵染率的影響

從表1可知，3個不同屬的AM真菌都能侵染白三葉根系，菌根侵染率范圍為66.80% ～82.51%，其中G.versiforme對白三葉根系的侵染率最高，且顯著高于其他2個菌種，而D.spurca和P.occultum接種處理間沒有顯著差異。

2.2 不同AM真菌對白三葉生物量的影響

表1還表明，3種AM真菌接種都能顯著地提高白三葉地上部干重、地下部干重、植株總干重，各個菌種處理間也表現顯著差異，其中G.versiforme處理的效果最好，且顯著高于D.spurca和P.occultum的處理，而D.spurca和P.occultum處理間沒有表現顯著差異。此外，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接種處理顯著地抑制了根冠比，分別抑制17%，16%和17%，各個菌種處理間沒有表現顯著差異。

表1 3種AM真菌對白三葉菌根侵染率和生物量的影響(n=3)Table 1 Effects of three AM fungi on mycorrhizal colonization and biomass production of white clover(n=3)

2.3 不同AM真菌對白三葉根系構型的影響

圖1顯示，接種AM真菌的白三葉根系構型明顯地優于未接種AM真菌的對照。表2也顯示，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接種顯著提高白三葉植株根系構型參數如長度、投影面積、表面積、體積、根尖數(除D.spurca外)、分支數和交叉數。在3個AM真菌處理中，以G.versiforme處理的效果最明顯，對根長度、投影面積、表面積、體積、根尖數、分支數和交叉數分別提高44%，42%，38%，42%，86%，57%和56%。但是，所有的AM真菌處理都沒有顯著地改變根系平均直徑。

表2 3種AM真菌對白三葉根系構型的影響(n=3)Table 2 Effect of three AM fungi on root system architecture of white clover(n=3)

圖1 接種不同AM真菌的白三葉根系構型Fig.1 Root system architecture of white clover plants inoculated with or without AM fungi

2.4 不同AM真菌對白三葉葉綠素以及蔗糖和葡萄糖含量的影響

表3顯示，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum都顯著地提高了白三葉葉綠素含量，分別提高36%，58%和38%，但3個AM真菌處理間沒有顯著差異。

另一方面，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum均顯著地提高了白三葉葉片和根系葡萄糖含量，在葉片中分別提高51%，43%和26%，在根系中提高35%，66%和33%(表3);D.spurca接種的葉片葡萄糖含量顯著高于P.occultum，G.versiforme接種處理的根系葡萄糖含量最高，顯著高于其他2個菌種處理，而D.spurca和P.occultum處理間無差異。接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum也顯著地提高了白三葉葉片蔗糖含量，分別提高54%，32%和16%，3個菌種處理間均存在顯著差異。在根系中，接種D.spurca和P.occultum顯著提高了其蔗糖含量，分別提高了23%和38%，2個菌種處理間無顯著差異;而G.versiforme則顯著降低其蔗糖含量，降低了45%。

表3 3種AM真菌對白三葉葉綠素以及蔗糖和葡萄糖含量的影響(n=3)Table 3 Effects of three AM fungi on chlorophyll，glucose and sucrose contents of white clover(n=3)

3 討論

許多研究已經證實，接種AM真菌能夠促進植物生長，如株高、莖粗、葉片數、生物量等［16-17］。本研究也證實，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum能夠顯著提高白三葉的地上部、地下部及植株總干重，其中以G.versiforme的效果最顯著。畢銀麗等［18］研究結果也表明，生長基質施磷肥與否對AM真菌促進白三葉生物量效果沒有影響。這種提高一方面與根外菌絲參與水分和養分有關［19］，另一方面也與接種AM真菌后改善白三葉根系構型相關，因為根系構型的改善能夠幫助植物從土壤中吸收更多的礦質營養和水分，而增加生物量的效果因AM真菌的種類不同而表現出差異。此外，接種AM真菌降低了白三葉的根冠比，這暗示著叢枝菌根真菌對植株地上部分的促進作用大于地下部分。

本研究表明，接種AM真菌的白三葉根系構型參數如長度、投影面積、表面積、體積、根尖數、分支數和交叉數顯著高于不接種AM真菌的對照，其中以G.versiforme處理的效果最明顯，說明AM真菌作為一種有益微生物能夠影響白三葉的根系構型，且顯示了促進的效應。這與Wu等［20］在紅橘(Citrus tangerine)上接種G.mosseae的研究結果一致。Yao等［8］在枳(Poncirus trifoliata)上接種 G.caledonium、G.intraradices、G.versiforme和 Gigaspora margarita的研究結果表明，AM真菌沒有顯著改變這些根系構型參數。這暗示了叢枝菌根改善根系構型依賴寄主植物和AM真菌兩者的兼容性。AM真菌改善根系構型可能與AM真菌誘導根系腐胺合成酶活性正相關，從而調節內源多胺代謝，進而影響根系構型［20］。

AM真菌屬于異養型真菌，需從寄主體內獲取碳源，根內菌絲主要從根系中吸收己糖，優先于葡萄糖，從而在根系建立“菌根碳庫”［10-11］。本研究表明，接種AM真菌顯著提高了白三葉葉片和根系的葡萄糖含量，其中接種G.versiforme的效果最顯著。菌根化植株組織內更高的葡萄糖含量為AM的發育提供了碳源。接種AM真菌的白三葉葉片蔗糖含量顯著高于未接種的對照，根系中的蔗糖含量除接種G.versiforme外，都高于未接種的植株。這充分說明AM存在能夠有利于根系碳庫的積累，特別是葡萄糖。AM真菌通過提高寄主植物(如本研究的三葉草)葉綠素含量，因而改善植物的光合參數，提高植株葉片光合速率，間接獲得比對照更多的碳水化合物，進而改善植物的碳素營養［21］。相關性分析顯示，白三葉葉片的葡萄糖(r=0.852，P＜0.01)和蔗糖含量(r=0.722，P＜0.01)以及根系葡萄糖含量(r=0.884，P＜0.01)均與菌根侵染率呈極顯著的正相關關系。進一步暗示更高的葡萄糖將有利于AM的形成和發育。在本研究中接種G.versiforme的白三葉根系蔗糖含量低于沒接種的對照，可能是白三葉對G.versiforme的依賴性強(植株生物量和菌根侵染率均最高)，根系中的蔗糖更多地降解成葡萄糖供AM發育，因而建立最高的菌根侵染率，導致根系蔗糖含量的下降。蔗糖的裂解依賴蔗糖酸性轉化酶、中心轉化酶、堿性轉化酶以及蔗糖合成酶(分解方向)，AM真菌對白三葉蔗糖裂解酶有何影響，還需進一步深入研究。

此外，根系的生長和發育也依賴植物形成的光合碳水化合物，主要以蔗糖為底物［9，22］。這些碳水化合物可直接作為代謝底物或生長調節物質影響細胞的分裂，導致根系構型發生變化［23］。在菌根化植物中由于“菌根碳庫”的存在，地上部分的蔗糖經長距離運輸向根系的分配比率提高［10］。所以，在菌根化白三葉中接種AM真菌(除G.versiforme外)顯著提高其根系蔗糖的含量。菌根誘導的蔗糖一方面被分解成葡萄糖，供AM的生長發育，另一方面為根系的發育提供了代謝底物，有利于根系構型的建立。因此，可以推斷，在植物根系中接種AM真菌，能提高寄主植物葉片的蔗糖向地下根系的分配，從而有助于AM的發育，進一步發揮AM的水分和養分吸收功能，也有利于根系構型的建立。

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