東祁連山高寒草地幾株醉馬草內生細菌的生物功能評價及鑒定

楊成德，王穎，王玉琴，姚玉玲，薛莉，徐長林，陳秀蓉

（草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院甘肅省草業(yè)工程實驗室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州730070）

植物內生細菌是指整個生活周期或部分階段在健康植物組織內棲居而對植物不造成實質性危害的細菌，即與植物建立了和諧聯(lián)合關系并與宿主協(xié)同進化的微生物［1］；一方面，植物體為其提供生長必需的場所和營養(yǎng)等；另一方面，部分內生細菌具有抑菌、固氮、產生吲哚乙酸（IAA）及溶磷等生物功能，可以增強宿主植物的抗蟲性、抗病性、抗旱性及生長競爭能力等［2－3］，其產生的生物活性物質、抗逆境相關酶的（超）表達及誘導抗性也能直接或間接有利于宿主植物，加強或調節(jié)了植物營養(yǎng)的獲得、新陳代謝和對逆境的忍耐能力等。因此，植物內生細菌是一個潛在的巨大的微生物資源庫，其生物防治功能已成為內生細菌研究的熱點之一。Liu等［4］報道了內生沙雷氏細菌G3潛在的生防應用價值；Vetrivelkalai等［5］報道了內生菌對根結線蟲的防病潛力及對植物的促生潛力；高曉星等［6］和李振東等［7］報道了高寒草地珠芽蓼（Polygonumviviparum）等植物內生細菌對多種植物病原真菌的抑制作用；也有學者［8－10］報道了植物內生細菌的促生及對宿主真菌性病害的防御作用。醉馬草（Achnatherum inebrians）為禾本科（Gramineae）芨芨草屬（Achnatherum）的多年生草本植物，生命力和繁殖力極強，有超強的耐旱力，是我國北方天然草原主要的烈性毒草之一，有關其內生真菌的相關報道較多［11－12］，內生細菌方面張雪兵等［13－14］報道了在新疆的相關研究，高寒草地醉馬草內生細菌的相關研究未見報道。高寒草地醉馬草內生細菌生物功能如何？有沒有開發(fā)為生物農藥的潛力？基于此，本試驗對從東祁連山高寒草地醉馬草中分離獲得的6株內生細菌的生物功能進行了評價，并利用16SrDNA序列分析，結合形態(tài)特征對其進行了鑒定，以期為植物病害生物防治提供菌種資源，也為高寒草地醉馬草內生細菌的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用于植物病原真菌的培養(yǎng)和對峙試驗、肉汁胨培養(yǎng)基（NA）用于內生細菌的分離、純化和保存等［15］，金氏（King）培養(yǎng)基用于產IAA試驗，Pikovaskaia培養(yǎng)基（PKO）和蒙金娜培養(yǎng)基分別用于溶解無機磷和有機磷試驗。

1．1．2 供試菌 供試內生細菌：2012年7月分離自東祁連山高寒草地醉馬草根和葉的內生細菌。

供試病原菌：馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichumcoccodes），馬鈴薯枯萎病菌（Fusariumavenaceum）和馬鈴薯壞疽病菌（Phomafoveata），由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院植物病理實驗室提供。

1．2 內生細菌的分離純化

將醉馬草組織用自來水清洗表面，晾干后稱取2g，表面消毒后置于無菌研缽中研碎，吸取植物組織研磨浸出液按10倍濃度梯度稀釋后，取0．2mL涂布于NA培養(yǎng)基，以最后一次洗滌水為對照，28℃培養(yǎng)3～7d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、邊緣整齊度及表面形態(tài)等分類，并純化后4℃保存?zhèn)溆茫?6］。

1．3 生物功能測定

1．3．1 拮抗能力測定 采用平板對峙法［5，15，17］測定抑菌效果。用直徑5mm打孔器取指示菌菌塊置于PDA平板中央，在其四周等距離接種活化后的內生細菌，4次重復，馬鈴薯壞疽病菌置于20℃培養(yǎng)，其他指示菌置于28℃培養(yǎng)，至對照滿皿后測量菌落直徑，計算抑菌率。

1．3．2 固氮能力測定 供試內生細菌菌懸液0．2mL接種于阿須貝無氮平板和液體培養(yǎng)基內，以無菌水為對照，3次重復，平板置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基置于120r／min振蕩培養(yǎng)，第7天平板上有菌落和液體培養(yǎng)基變渾濁者為陽性，記為“＋”，否則記為“－”。

1．3．3 溶磷能力測定 將0．2mL菌懸液涂布于Pikovaskaia’s培養(yǎng)基（PKO）［18］上，28℃培養(yǎng)14d后觀察解磷圈，3次重復；根據(jù)解磷圈與菌落直徑比值大小確定其溶磷能力。

1．3．4 產IAA能力測定 采用Salkowski比色法［19］。將0．1mL菌懸液分別接種于含100mg／L色氨酸和不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中，以加等量無菌水為對照，于28℃、120r／min恒溫振蕩培養(yǎng)12d，取50μL加入等量比色液（PC比色液或S2比色液），室溫靜置15min后，觀察顯色反應，3次重復均變紅色表示能分泌IAA，記“＋”，否則記“－”。

1．4 內生細菌的鑒定

1．4．1 培養(yǎng)形狀觀察［20］在NA固體培養(yǎng)基上觀察內生細菌菌落形態(tài)特征并描述和照相。

1．4．2 形態(tài)觀察 內生細菌在NA平板上經(jīng)18～24h活化培養(yǎng)后革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體顏色和形態(tài)，隨機測量30個菌體的長和寬，并顯微拍照。

1．4．3 16SrDNA鑒定［5］利用16SrDNA通用引物，其序列為：引物1為5′－CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA－3′，引物2為5′－CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT－3′。內生細菌活化后在LB培養(yǎng)液28℃振蕩過夜培養(yǎng)，后按上海生工試劑盒說明書提取DNA，經(jīng)電泳檢測具特異性DNA條帶的樣品進行PCR擴增。擴增體系為：10×buffer 2．5μL，dNTP（5mmol／L）0．5μL，MgCl2（25mmol／L）2．5μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0．3μL，引物（10μmol／L）1和2各0．5μL，模板DNA 0．5μL（以加0．5μL ddH2O為對照），補ddH2O至25μL；擴增程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s；65℃退火40s；72℃延伸90s；30個循環(huán)；72℃延伸8min。經(jīng)電泳檢測在1500bp處具特異性條帶的擴增產物測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列相似性比較（http：∥www．ncbi．nlm．nihgov／blast．cgi），并用Clustal（1．8）軟件進行多重序列比較和用 Mega（4．0）軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學地位。

2 結果與分析

2．1 內生細菌的分離純化

從接種醉馬草組織浸提液的平板上依據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小等挑取不同單菌落，反復劃線純化后從醉馬草中分離出6株內生細菌，其中根部4株，葉部2株，分別編號為261MG1、261MG2、261MG3、261MG4、261MY5和261MY6，保存?zhèn)溆茫粚φ諞]有細菌菌落長出，說明表面消毒徹底，所得細菌均為內生細菌。

2．2 生物功能測定

經(jīng)對峙培養(yǎng)，261MY5對3種指示菌的拮抗作用均較差，其他5株內生菌株對3種指示菌均有較強的抑菌作用，其中對馬鈴薯壞疽病菌最強為261MY6，其抑菌率為69．62%，最弱為261MG3，其抑菌率為55．69%；對馬鈴薯枯萎病菌最強為261MY6，其抑菌率為64．51%，最弱為261MG1，其抑菌率僅為27．68%；對馬鈴薯炭疽病菌最強為261MY6，其抑菌率為83．65%，最弱為261MG2，其抑菌率也達73．39%。綜合來看，對馬鈴薯炭疽病的拮抗作用最明顯，其中261MY6對3種指示菌的拮抗作用最強，其抑菌率最低也達69．62%，最高達83．65%（圖1，表1）。該結果說明6株醉馬草內生細菌均具有抑菌能力，且多個菌株均具有一菌多防功能，在微生物農藥開發(fā)中潛力巨大。

圖1 261MY6的抑菌作用Fig．1 The antagonism effect of 261MY6

表1 醉馬草內生細菌的生物功能測定Table 1 Determination of biological functions on endophyte bacterium from A． inebrians

6株醉馬草內生細菌中除261MG4外均能固氮，但均不能溶解有機磷，261MG4，261MG3和261MG6對無機磷有較弱的溶解能力，6株內生細菌均能產IAA（表1）。該結果說明醉馬草內生細菌具有功能多樣性。

2．3 內生細菌的鑒定

2．3．1 培養(yǎng)形狀觀察 261MG1：菌落直徑3mm，圓形，邊緣整齊，表面褶皺，中心凹陷，呈草帽狀，較干燥，整體呈淡紅色，可產生紅色色素致培養(yǎng)基變紅（圖2）。

261MG2：菌落直徑13mm，不規(guī)則形，邊緣不整齊，表面褶皺，中心凹陷，較濕潤，產生紅色色素致培養(yǎng)基變紅（圖2）。

261MG3：菌落直徑5mm，橢圓或圓形，邊緣整齊，表面褶皺，菌落中央低陷，呈草帽狀，菌落呈淡紅色（圖2）。

261MG4：菌落直徑2mm，圓形，邊緣整齊，中心凹陷，呈草帽狀，菌落為淡紅色（圖2）。

261MY5：菌落直徑4mm，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈臺狀，半透明，米白色（圖2）。

261MY6：菌落直徑3mm，圓形，邊緣整齊，表面褶皺，中央稍低陷，奶白色（圖2）。

從6株內生細菌培養(yǎng)性狀看醉馬草內生細菌在形態(tài)上存在多樣性。

圖2 內生細菌的培養(yǎng)性狀Fig．2 Culture character of endophyte bacterium from A． inebrians

圖3 內生細菌的革蘭氏染色Fig．3 Gram stain of endophyte bacterium from A． inebrians

2．3．2 形態(tài)觀察 6株醉馬草內生細菌均為革蘭氏陽性和桿狀（圖3），但菌體大小差別較大，菌體最長的為261MG3，其長度達2．09μm，菌體最寬的為261MG2，其寬度為0．77μm，其他菌株長和寬介于這兩數(shù)值間（表2）。

2．3．3 16SrDNA鑒定 獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對和構建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，261MG1、261MG2、261MG3和261MY6分別與芽孢桿菌屬的Bacillussubtilis（JX848636）、Bacillusaxarquiensis（GU568194）、Bacillusmojavensis（JF496257）和Bacillusamyloliquefaciens（KC752450）的一致性在99%以上，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起（圖4），初步將其分別鑒定為芽孢桿菌屬的Bacillussubtilis、Bacillusaxarquiensis、Bacillusmojavensis和Bacillusamyloliquefaciens，261MG4與Brevibacteriumhalotolerans（HE970648）的一致性在99%以上，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起（圖4），初步鑒定其為短桿菌屬的Brevibacteriumhalotolerans，261MY5與Clavibactersp．（JX164054）的一致性在99%以上（圖4），且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步鑒定其為棒形桿菌屬細菌。該結果表明，6株內生細菌分屬于3個屬6個種，說明醉馬草內生細菌也具有種類多樣性，但芽孢桿菌屬細菌4株，占66．7%，為優(yōu)勢類群。

表2 內生細菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological character of endophyte bacterium from A． inebrians

圖4 醉馬草內生細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Phylogenetic tree of endophyte bacterium from A． inebrians

3 討論

植物內生細菌分布廣、種類多，幾乎存在于所有已研究過的陸生及水生植物中，在各種農作物及經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的內生細菌已超過120種［21］；由于內生菌生境的特殊性，其產生的生物活性物質、抗逆境相關酶的（超）表達及誘導抗性均直接或間接有利于宿主植物，即存在內生細菌的宿主植物往往具有生長快速、抗逆境和抗病害等特點，比未感染內生菌的植物更具生存競爭力。內生細菌在植物體內具有獨立繁殖和傳導特性，且很多內生細菌具有拮抗和促生作用，具有開發(fā)為微生物農藥和肥料的潛力。所以，拮抗內生細菌的篩選和應用在提倡綠色農藥的今天也逐漸成為植物病害防治研究中的熱點［21－22］。本試驗從醉馬草體內分離出6株內生細菌，其中有5株對馬鈴薯壞疽病菌有較好的抑制效果，最高抑菌率達69．62%，4株對馬鈴薯枯萎病菌有較好的抑制效果，最高抑菌率達64．51%，對馬鈴薯炭疽病的拮抗作用最明顯，最低抑菌率達73．39%。6株醉馬草內生菌中261MY6具有一菌多防的效果，且具有固氮、溶磷和產生IAA能力，是開發(fā)植物病害生物菌劑的良好菌種資源；其他菌株單用功能略低于261MY6，可以通過篩選協(xié)同作用的菌株復配以提高其生物功能，如張英等［23］報道菌株復配后產IAA量顯著高于單菌株。6株內生細菌在形態(tài)、大小及培養(yǎng)性狀上均有差異，根據(jù)培養(yǎng)性狀及16SrDNA序列分析鑒定6株內生細菌分屬于3個屬6個種，其中芽孢桿菌屬細菌占4株，占66．7%。該結果說明醉馬草內生細菌具有功能、種類及形態(tài)多樣性，且芽孢桿菌為主要類群［24］。本試驗從醉馬草根部獲得4株，葉片獲得2株，總體數(shù)量較少，此可能與東祁連山高寒草地醉馬草本身有關系，同樣的分離方法從線葉嵩草（Kobresiacapillifolia）及針茅（Stipacapillata）等植物中均可分離獲得較多的菌株；也可能與所使用培養(yǎng)基有關系，醉馬草內生細菌需要的營養(yǎng)組成與其他牧草內生細菌有差異，致分離數(shù)量偏少；或可能與消毒使用的消毒劑有關系，化學方法可能殺死部分內生細菌，導致內生細菌的數(shù)量或種類減少［3］，但此有待進一步研究。本試驗關于醉馬草內生細菌的防病促生研究主要集中在室內，豐富了東祁連山高寒草地內生細菌的研究，但這些內生細菌能否開發(fā)為微生物農藥或肥料應用于生產有待于進一步研究。

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