生長期和品種對靈芝萃取物三萜含量的影響

李淑芳+陳曉明+羅瑩+李鳳美+翟宏偉+張志軍

摘 要：利用HPLC指紋圖譜技術，分析同一菌株的不同生長期、不同品種靈芝的有機溶劑萃取物中的三萜指紋的情況，并比較不同生長期和不同品種之間的差異。結果顯示，靈芝生長期間，萃取物的HPLC圖譜相似度較高，均>0.93；且子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定；然而靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積，則是第二生長階段最大，第一生長階段最小。這說明應生長發育之需求，靈芝三萜的各組分和總量在不斷變化。另外，研究中的6個靈芝品種，三萜萃取物的HPLC指紋圖譜相似度均<0.90；比較靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜總峰面積發現，美芝（MZ）最大，其次是G4、G9、京大（JD）、南韓（NH），最小是G18。

關鍵詞：靈芝；三萜化合物；HPLC指紋圖譜

中圖分類號：S567.3+1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.004

Effect of Different Growing Periods and the Different Variety of Ganoderma lucidum on Contents of Ganoderma Triterpene Extracting

LI Shu-fang， CHEN Xiao-ming， LUO Ying， LI Feng-mei， ZHAI Hong-wei， ZHANG Zhi-jun

（Forestry and Fruit Trees Research Institute of Tianjin，Tianjin 300112， China）

Abstract： The contents of organic solvents extracting of Ganoderma Triterpene（GT） of the different growing period and the different variety of Ganoderma lucidum were analyzed and compared by HPLC fingerprints. The results showed that the similarity degree about HPLC fingerprints of organic solvents extracting of GT were all more than 0.93， and from the fruiting body differentiating to mature period， the GT kinds were basically stable. But the total peak area of GT extracting HPLC fingerprints was biggest on the second growing period； and the total peak area was the smallest on first period. It suggests that various components and total contents of GT change constantly with Ganoderma lucidum growing. Moreover， the similarity degree about HPLC fingerprints of GT extracting about six variety were all less than 0.90. Compared the total peak areas of GT extracting HPLC fingerprints， the results showed that the biggest was MZ； secondly， G4、G9、JD、NH； the smallest was G18.

Key words： Ganoderma lucidum； triterpene； HPLC fingerprints

收稿日期：2013-10-21；修訂日期：2013-11-07

作者簡介：李淑芳（1976—），女，山西人，副研究員，碩士，主要從事食藥用菌精深加工研究及其產品開發。

通訊作者簡介：張志軍（1969—），男，天津人，研究員，主要從事食用菌栽培與精深加工研究。

靈芝Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.）P.Karst.，屬于擔子菌門Basidiomycota，靈芝科Ganodermataceae，靈芝屬Ganoderma P. karst.。它是我國最為名貴的藥用真菌之一。近年來，關于靈芝的研究已得到東南亞國家以及美國、加拿大等國有關學者的廣泛關注。大量現代研究表明，靈芝含多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白質、多肽、脂肪酸等多種生物活性成分。靈芝三萜是靈芝的關鍵藥效成分，主要是一類高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有重要的藥理作用，如抗腫瘤，抗細胞毒性，抗HIV-1型病毒，護肝，解毒等，且具有誘導NADPH、改善記憶力等功能[1-6]。近期研究表明，靈芝酸A、F、H具有阻止乳癌生長和作為治療癌癥輔助劑的作用，赤芝酸具有通過線粒體介導的途徑誘導人體白細胞凋亡以及阻止癌細胞侵染的作用等[2]；靈芝Me和靈芝酸T具有抗肺癌腫瘤作用[3]。但是，由于靈芝酸類化合物結構相似，且較難得到足量對照品化合物，從而使三萜含量HPLC測定方法存在一定困難[2-8]。

近年來，指紋圖譜技術已成為研究和控制中草藥質量的一種主要方法，它能全面反映中藥所含化學成分的種類與數量，進而反映中藥的質量[9-10]。本研究應用HPLC指紋圖譜技術，研究不同品種和不同生長期對靈芝子實體三萜成分的影響，探討靈芝品種和生長期對三萜含量和種類的影響，為靈芝生產提供可靠依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

赤靈芝：來源于天津市天壽食用菌科技有限公司。靈芝品種：G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）。靈芝生長期：從靈芝子實體開始分化形成時，每間隔10 d采集的靈芝子實體，標記為S1、S2、S3和S4，分別表示第一生長階段、第二生長階段、第三生長階段和第四生長階段。靈芝三萜萃取物：課題組自制，方法見1.3.2。

甲醇（4 L、色譜純），冰醋酸（500 mL、分析純）：天津東科儀器設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1200高效液相色譜儀：真空脫氣機（G1322A），四元泵（G1311A），自動進樣器（1329A），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測器（G1315D），美國Agilent公司。Agilent化學工作站。旋轉蒸發器（RE52-2，上海滬西分析儀器廠有限公司）；分析天平（FA1004，上海方瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 um）；流動相：體積分數1%醋酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序（表1）；柱溫：25 ℃；進樣量5 μl；流量：0.8 mL·min-1；檢測波長：254 nm，參比波長360 nm。

1.3.2 供試品溶液的制備 稱取5 g靈芝樣品，按有機溶劑萃取方法：干燥靈芝→粉碎→95%乙醇提取→提取液濃縮→氯仿提取→提取液濃縮→褐色濃縮液，即為靈芝萃取物。然后取0.25 mL萃取物，甲醇定容至5 mL。再從中取1 mL，過0.45 μm濾膜待用[11-17]。

1.3.3 指紋圖譜軟件 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）。

1.3.4 總峰面積的計算 總峰面積=大于2%總峰面積的各峰面積的總和。

2 結果與分析

2.1 靈芝不同生長期的三萜萃取物HPLC圖譜比較

繪制不同生長期指紋圖譜重疊圖，選取24個共有色譜峰，如圖1所示。試驗結果表明，S1、S2、S3、S4各階段萃取物的HPLC圖譜相似度較高，均高于0.93。由圖1可以看出，子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定。這與邢增濤、Masao Hirotani等人的研究報道是一致的。

通過計算不同生長期總峰面積，表2結果顯示，第二生長階段總峰面積和最大，第一生長階段則最小。

由圖2可以看出，1～9號色譜峰均在第二生長階段（S2），峰面積較大，而10～14號色譜峰在第三生長階段（S3），峰面積也較大。這可能是因為，在靈芝成長中，由于三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

2.2 不同品種靈芝三萜萃取物的HPLC圖譜比較

圖3中S1～S6分別為G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）等6個品種。圖3結合表3，比較結果表明，各品種間相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大和南韓；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8。

表4結果顯示，不同品種靈芝萃取物的HPLC總峰面積大小順序為美芝（MZ）、G4、G9、京大（JD）、南韓（NH）、G18。

3 結論與討論

經HPLC高效液相指紋圖譜軟件分析，不同生長階段所得靈芝子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度較高，均大于0.93；且子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定，但在靈芝子實體噴孢子之時，靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積最大。這可能是因為，在靈芝成長中三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

靈芝的6個品種G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4和美芝（MZ），各品種間子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大（JD）和南韓（NH）；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝（MZ）和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8；此外，按靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積大小排序為：美芝（MZ）>G4>G9>京大（JD）>南韓（NH）>G18。

參考文獻：

[1] 陶文沂，敖宗華，許泓瑜.藥食用真菌生物技術[M]. 北京：化學工業出版社（生物醫藥出版分社）， 2007.

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[4] 趙佳，陳曉輝，畢開順. HPLC同時測定赤芝中4種三萜酸的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（17）：2220.

[5] 王筱婧，林煥冰，徐江，等. HPLC法和UV-vis法測定靈芝孢子粉中靈芝三萜及靈芝多糖的含量[J]. 當代醫學，2009，15（31）：128.

[6] 馮娜，張勁松，唐慶九，等. 靈芝三萜的HPLC檢測方法的研究[C]//第九屆全國食用菌學術研討會摘要集.上海：中國菌物學會、中國農學會食用菌分會，2010：57.

[7] 付立忠，吳學謙，李明焱，等. 靈芝不同生長發育期粗多糖和三萜含量變化規律[J]. 食用菌學報，2008，15（3）：47-50.

[8] 楊娟娟，李曄，魏巧榮，等.RP-HPLC法測定子實體中靈芝酸A的含量[C]//第九屆食用菌學術研討會摘要集.上海：中國菌物學會、中國農學會食用菌分會，2010：56.

[9] 羅國安，梁瓊麟，王義明著. 中藥指紋圖譜——質量評價、質量控制與新藥研發[M]. 1版. 北京：化學工業出版社，2009.

[10] 黃書銘，楊新林，黃健等.靈芝三萜類化合物高效液相指紋圖譜研究[J].北京理工大學學報，2004，24（5）：458.

[11] 徐懷德.天然產物提取工藝學[M].北京：輕工業出版社，2006：367.

[12] 黎海彬，張敏，王邑等.植物三萜皂苷的提取分離技術[J].食品工業科技，2006，27（1）：201-203.

[13] 黃小琴，鄭林用，彭衛紅. 靈芝多糖與三萜類的提取純化工藝研究進展[J]. 食用菌學報，2005，12（3）：56-62.

[14] 周婷，王家珗，肖小玥. 天然產物樣品前處理分離分析聯用技術研究進展[J]. 世界科學技術：中醫藥現代化，2009，11（1）：147.

[15] 鐘露苗.三萜皂苷提取分離和結構鑒定技術[J].中醫藥學刊，2004，22（4）：760-762.

[16] 馬林，吳豐，陳若蕓. 靈芝三萜成分分析[J].藥學學報，2003，38（1）：50-52.

[17] 張憲民，喬英，邱明華. 紫芝中三萜化合物標準化提取方法研究[J].天然產物研究與開發，2007，19（1）：109-112.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

赤靈芝：來源于天津市天壽食用菌科技有限公司。靈芝品種：G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）。靈芝生長期：從靈芝子實體開始分化形成時，每間隔10 d采集的靈芝子實體，標記為S1、S2、S3和S4，分別表示第一生長階段、第二生長階段、第三生長階段和第四生長階段。靈芝三萜萃取物：課題組自制，方法見1.3.2。

甲醇（4 L、色譜純），冰醋酸（500 mL、分析純）：天津東科儀器設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1200高效液相色譜儀：真空脫氣機（G1322A），四元泵（G1311A），自動進樣器（1329A），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測器（G1315D），美國Agilent公司。Agilent化學工作站。旋轉蒸發器（RE52-2，上海滬西分析儀器廠有限公司）；分析天平（FA1004，上海方瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 um）；流動相：體積分數1%醋酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序（表1）；柱溫：25 ℃；進樣量5 μl；流量：0.8 mL·min-1；檢測波長：254 nm，參比波長360 nm。

1.3.2 供試品溶液的制備 稱取5 g靈芝樣品，按有機溶劑萃取方法：干燥靈芝→粉碎→95%乙醇提取→提取液濃縮→氯仿提取→提取液濃縮→褐色濃縮液，即為靈芝萃取物。然后取0.25 mL萃取物，甲醇定容至5 mL。再從中取1 mL，過0.45 μm濾膜待用[11-17]。

1.3.3 指紋圖譜軟件 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）。

1.3.4 總峰面積的計算 總峰面積=大于2%總峰面積的各峰面積的總和。

2 結果與分析

2.1 靈芝不同生長期的三萜萃取物HPLC圖譜比較

繪制不同生長期指紋圖譜重疊圖，選取24個共有色譜峰，如圖1所示。試驗結果表明，S1、S2、S3、S4各階段萃取物的HPLC圖譜相似度較高，均高于0.93。由圖1可以看出，子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定。這與邢增濤、Masao Hirotani等人的研究報道是一致的。

通過計算不同生長期總峰面積，表2結果顯示，第二生長階段總峰面積和最大，第一生長階段則最小。

由圖2可以看出，1～9號色譜峰均在第二生長階段（S2），峰面積較大，而10～14號色譜峰在第三生長階段（S3），峰面積也較大。這可能是因為，在靈芝成長中，由于三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

2.2 不同品種靈芝三萜萃取物的HPLC圖譜比較

圖3中S1～S6分別為G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）等6個品種。圖3結合表3，比較結果表明，各品種間相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大和南韓；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8。

表4結果顯示，不同品種靈芝萃取物的HPLC總峰面積大小順序為美芝（MZ）、G4、G9、京大（JD）、南韓（NH）、G18。

3 結論與討論

經HPLC高效液相指紋圖譜軟件分析，不同生長階段所得靈芝子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度較高，均大于0.93；且子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定，但在靈芝子實體噴孢子之時，靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積最大。這可能是因為，在靈芝成長中三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

靈芝的6個品種G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4和美芝（MZ），各品種間子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大（JD）和南韓（NH）；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝（MZ）和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8；此外，按靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積大小排序為：美芝（MZ）>G4>G9>京大（JD）>南韓（NH）>G18。

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[7] 付立忠，吳學謙，李明焱，等. 靈芝不同生長發育期粗多糖和三萜含量變化規律[J]. 食用菌學報，2008，15（3）：47-50.

[8] 楊娟娟，李曄，魏巧榮，等.RP-HPLC法測定子實體中靈芝酸A的含量[C]//第九屆食用菌學術研討會摘要集.上海：中國菌物學會、中國農學會食用菌分會，2010：56.

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[11] 徐懷德.天然產物提取工藝學[M].北京：輕工業出版社，2006：367.

[12] 黎海彬，張敏，王邑等.植物三萜皂苷的提取分離技術[J].食品工業科技，2006，27（1）：201-203.

[13] 黃小琴，鄭林用，彭衛紅. 靈芝多糖與三萜類的提取純化工藝研究進展[J]. 食用菌學報，2005，12（3）：56-62.

[14] 周婷，王家珗，肖小玥. 天然產物樣品前處理分離分析聯用技術研究進展[J]. 世界科學技術：中醫藥現代化，2009，11（1）：147.

[15] 鐘露苗.三萜皂苷提取分離和結構鑒定技術[J].中醫藥學刊，2004，22（4）：760-762.

[16] 馬林，吳豐，陳若蕓. 靈芝三萜成分分析[J].藥學學報，2003，38（1）：50-52.

[17] 張憲民，喬英，邱明華. 紫芝中三萜化合物標準化提取方法研究[J].天然產物研究與開發，2007，19（1）：109-112.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

赤靈芝：來源于天津市天壽食用菌科技有限公司。靈芝品種：G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）。靈芝生長期：從靈芝子實體開始分化形成時，每間隔10 d采集的靈芝子實體，標記為S1、S2、S3和S4，分別表示第一生長階段、第二生長階段、第三生長階段和第四生長階段。靈芝三萜萃取物：課題組自制，方法見1.3.2。

甲醇（4 L、色譜純），冰醋酸（500 mL、分析純）：天津東科儀器設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1200高效液相色譜儀：真空脫氣機（G1322A），四元泵（G1311A），自動進樣器（1329A），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測器（G1315D），美國Agilent公司。Agilent化學工作站。旋轉蒸發器（RE52-2，上海滬西分析儀器廠有限公司）；分析天平（FA1004，上海方瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 um）；流動相：體積分數1%醋酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序（表1）；柱溫：25 ℃；進樣量5 μl；流量：0.8 mL·min-1；檢測波長：254 nm，參比波長360 nm。

1.3.2 供試品溶液的制備 稱取5 g靈芝樣品，按有機溶劑萃取方法：干燥靈芝→粉碎→95%乙醇提取→提取液濃縮→氯仿提取→提取液濃縮→褐色濃縮液，即為靈芝萃取物。然后取0.25 mL萃取物，甲醇定容至5 mL。再從中取1 mL，過0.45 μm濾膜待用[11-17]。

1.3.3 指紋圖譜軟件 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）。

1.3.4 總峰面積的計算 總峰面積=大于2%總峰面積的各峰面積的總和。

2 結果與分析

2.1 靈芝不同生長期的三萜萃取物HPLC圖譜比較

繪制不同生長期指紋圖譜重疊圖，選取24個共有色譜峰，如圖1所示。試驗結果表明，S1、S2、S3、S4各階段萃取物的HPLC圖譜相似度較高，均高于0.93。由圖1可以看出，子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定。這與邢增濤、Masao Hirotani等人的研究報道是一致的。

通過計算不同生長期總峰面積，表2結果顯示，第二生長階段總峰面積和最大，第一生長階段則最小。

由圖2可以看出，1～9號色譜峰均在第二生長階段（S2），峰面積較大，而10～14號色譜峰在第三生長階段（S3），峰面積也較大。這可能是因為，在靈芝成長中，由于三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

2.2 不同品種靈芝三萜萃取物的HPLC圖譜比較

圖3中S1～S6分別為G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）等6個品種。圖3結合表3，比較結果表明，各品種間相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大和南韓；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8。

表4結果顯示，不同品種靈芝萃取物的HPLC總峰面積大小順序為美芝（MZ）、G4、G9、京大（JD）、南韓（NH）、G18。

3 結論與討論

經HPLC高效液相指紋圖譜軟件分析，不同生長階段所得靈芝子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度較高，均大于0.93；且子實體從開始分化形成時到子實體成熟期間，三萜類化合物的種類基本穩定，但在靈芝子實體噴孢子之時，靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積最大。這可能是因為，在靈芝成長中三萜類化合物存在不斷地分解與合成等代謝過程，導致不同生長期三萜量不同。

靈芝的6個品種G9、G18、南韓（NH）、京大（JD）、G4和美芝（MZ），各品種間子實體三萜萃取物的HPLC圖譜的相似度均小于0.90，其中，相似度為0.857的是京大（JD）和南韓（NH）；相似度為0.839的是G9和G18；相似度為0.817的是美芝（MZ）和G18；而G4品種與其它品種的相似度均低于0.8；此外，按靈芝三萜萃取物的HPLC指紋圖譜的總峰面積大小排序為：美芝（MZ）>G4>G9>京大（JD）>南韓（NH）>G18。

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