不同基因型青花菜游離小孢子培養(yǎng)和植株再生

邊立娜+彭永康+孫德嶺+單曉政+文正華

摘 要：以5個(gè)基因型的青花菜品種為供試材料，采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，研究基因型對(duì)小孢子胚芽誘導(dǎo)和植株再生的影響。結(jié)果表明：基因型是影響小孢子胚芽誘導(dǎo)率的重要因子。

關(guān)鍵詞：青花菜；游離小孢子；胚狀體；植株再生

中圖分類(lèi)號(hào)：S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.003

Isolated Microspore Culture and Plant Regeneration in Different Genotypes of Broccoli

BIAN Li-na1， PENG Yong-kang1， SUN De-ling2， SHAN Xiao-zheng2，WEN Zheng-hua2

（1.Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China）

Abstract： Five different genotypes of broccoli were used as experimental materials in this paper and the plant regeneration factors of microspore embryoids and effects of genotypes on embryonic induction rate were studied. The results showed that the genotype was the most important factor on the inducing rate of microspore-derived embryos.

Key words： Brassica oleracea var. italic； micropore culture； embryoid； plant regeneration

收稿日期：2013-10-18；修訂日期： 2013-11-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25-A-13）

作者簡(jiǎn)介：邊立娜（1988—），女，天津人，在讀碩士生，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：孫德嶺（1961—），男，河北玉田人，研究員，博士，主要從事花椰菜育種研究。

青花菜（ Brassica oleracea var. italica） ，俗名綠菜花。由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，尤其是在抗癌功能上為同類(lèi)蔬菜之首，深受消費(fèi)者青睞。我國(guó)青花菜品種多為國(guó)外引進(jìn)，種子昂貴。為培育新的種質(zhì)資源，育成優(yōu)質(zhì)青花菜品種，常規(guī)方法需經(jīng)過(guò)雜交、回交和自交分離，選育出理想的材料常常需要好幾個(gè)世代。而在青花菜育種中利用小孢子組織培養(yǎng)，不僅可快速得到雙單倍體純系，還可大大縮短育種年限[1-4]。自1982年至今，甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體后，國(guó)內(nèi)外利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬作物上相繼取得成功[5]，1991年Takahata等[6]首次利用青花菜進(jìn)行了小孢子培養(yǎng)，隨后張德雙等[7]、王春麗[1]等也在青花菜游離小孢子培養(yǎng)上取得了成功。雖然小孢子培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，但很多學(xué)者側(cè)重于對(duì)小孢子胚胎發(fā)育的誘導(dǎo)因素進(jìn)行研究，本試驗(yàn)以5個(gè)不同基因型的青花菜為材料，對(duì)游離小孢子培養(yǎng)與植株再生進(jìn)行了研究，旨在完善青花菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，同時(shí)也可為青花菜的遺傳育種提供新的材料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料由天津科潤(rùn)蔬菜研究所提供，供試材料于2012年10月定植于天津市科潤(rùn)蔬菜所，采取常規(guī)栽培管理，翌年3—4月植株出現(xiàn)花蕾后，選取主花序上的花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

1.2 小孢子培養(yǎng)方法

參考張德雙等[7]的研究，取處于單核晚期和雙核早期的花蕾（4.1～5.0 mm）的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)。小孢子的分離、純化培養(yǎng)參考趙前程等[8]的方法，用50 g·L-1質(zhì)量濃度的次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，經(jīng)無(wú)菌水沖洗，用含蔗糖為100 g·L-1的B5培養(yǎng)基進(jìn)行游離、洗滌，用含蔗糖為130 g·L-1，pH 值5.8，添加6-BA（1 mg·L-1）和NAA（0.1 mg·L-1）的NLN液體培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，并添加一定的活性炭，培養(yǎng)密度為1×105～2×105個(gè)·mL-1，熱激后，置25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，利用倒置顯微鏡觀察小孢子發(fā)育進(jìn)展。

1.3 胚胎發(fā)生與胚培養(yǎng)

小孢子受到熱激后開(kāi)始細(xì)胞分裂，黑暗培養(yǎng)2周左右，肉眼可見(jiàn)胚狀體。30 d左右，胚狀體處于子葉期，轉(zhuǎn)移至添加6-BA（0.2 mg·L-1）和NAA（0.02 mg·L-1）的MS培養(yǎng)基上，形成再生芽。

1.4 植株再生與移植

將小孢子的再生芽在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，形成完整植株，對(duì)試管苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，擴(kuò)大植株數(shù)量，加快育種，經(jīng)過(guò)馴化移栽到含基質(zhì)的盆缽中，待小植株成活后，移栽至大田，進(jìn)行管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育觀察

經(jīng)過(guò)熱激的青花菜小孢子逐漸膨大（圖1-A），2周左右，小孢子從多細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，逐漸發(fā)育成球形胚（圖1-B）、心形胚（圖1-C）、魚(yú)雷胚（圖1-D）和子葉胚（圖1-E），將子葉胚置于光照下培養(yǎng)5～7 d，可見(jiàn)胚狀體萌發(fā)，10～15 d左右，形成叢壯苗（圖1-F），利用叢壯苗在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，7 d左右，可見(jiàn)植株的基部產(chǎn)生大量白色的粗壯的根，形成健壯植株（圖1-G）。

2.2 不同基因型小孢子胚誘導(dǎo)的差異比較

由表1可以看出，供試的5個(gè)材料中，只有兩個(gè)形成了小孢子胚，胚胎誘導(dǎo)成功率為40%。不同基因型的小孢子胚誘導(dǎo)成功頻率存在差異，11J-52每花蕾平均產(chǎn)胚數(shù)達(dá)到2.1個(gè)，而11J-63僅有0.5個(gè)。在未出胚的3個(gè)基因型中，11J-150和11J-158都觀察到了細(xì)胞膨大，11J-173觀察到了細(xì)胞分裂，說(shuō)明它們對(duì)培養(yǎng)條件產(chǎn)生了反應(yīng)，但卻未能繼續(xù)發(fā)育。由此可見(jiàn)，基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)育有明顯影響。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和開(kāi)花期存在分離情況見(jiàn)圖2。11J-52和11J-63兩種材料均未采用任何加倍處理，兩份材料產(chǎn)生的再生植株只有少部分植株不能表現(xiàn)出十字形花冠，而呈現(xiàn)出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交結(jié)角。

3 結(jié)論與討論

利用小孢子培養(yǎng)不僅能夠快速有效地獲得純系植株，加快青花菜的育種進(jìn)程，而且利用單倍體植株的突變來(lái)篩選抗病、抗旱、抗蟲(chóng)的青花菜植株顯得更加便捷[9]。

基因型是制約小孢子發(fā)育的重要因素[10]。在相同的試驗(yàn)條件下，不同基因型誘導(dǎo)小孢子發(fā)育的頻率差異很大，本研究中，基因型11J-52達(dá)2.1個(gè)，而11J-63則僅有0.5個(gè)，其他3個(gè)基因型（11J-150，11J-158，11J-173）則只有細(xì)胞膨大和部分細(xì)胞分裂，這個(gè)結(jié)果可以為青花菜游離小孢子培養(yǎng)提供理論依據(jù)。但是，關(guān)于小孢子培養(yǎng)的啟動(dòng)機(jī)制、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的研究仍在探究過(guò)程中。

本試驗(yàn)中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高溫?zé)峒た梢詥?dòng)小孢子分化，但是，熱激又會(huì)對(duì)小孢子造成一定的傷害，這與一些研究者得出的結(jié)果相類(lèi)似[11]，如何克服這一傷害，找出最適宜的高溫預(yù)處理方式、處理時(shí)間與溫度以增加出胚率還有待進(jìn)一步研究。此外，本試驗(yàn)獲得的再生植株均通過(guò)自然加倍所得，其可能是單倍體、多倍體及非整倍體構(gòu)成的混合群體。試驗(yàn)中觀察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍體。通過(guò)小孢子胚產(chǎn)生的再生植株在農(nóng)藝性狀上的差別與植株倍性之間的聯(lián)系還有待研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王春麗，王濤濤，張余洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中國(guó)蔬菜，2010（4）：36-40.

[2] 方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)若干技術(shù)研究初報(bào)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，18（2）：123-126.

[3] 湯青林，宋明，張鐘靈.甘藍(lán)類(lèi)蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，13（3）：98-103.

[4] 張曉芬，王曉武，張延國(guó)，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株研究[J].中國(guó)蔬菜，2005（1）：16-17.

[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105（5）：427-434.

[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74：235-242.

[7] 張德雙，曹鳴慶，秦智偉.青花菜游離小孢子培養(yǎng)、胚胎發(fā)生和植株再生[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1998，13（3）：102-106.

[8] 趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（6）：65-68.

[9] 李超，饒勇，陳靜，等.單倍體育種技術(shù)在油菜育種材料創(chuàng)新上的應(yīng)用研究Ⅱ.胚狀體培育及試管苗越夏[J].種子，2004，23（6）：68-70.

[10] 饒勇，徐涵，毛堂芬，等.單倍體育種技術(shù)在油菜育種材料創(chuàng)新上的應(yīng)用研究Ⅰ.甘藍(lán)型油菜游離小孢子胚狀體的誘導(dǎo)發(fā)生[J].種子，2003（1）：66-67.

[11] 陸瑞菊，王亦菲，孫月芳，等.提高青花菜游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（2）：1-4.

由表1可以看出，供試的5個(gè)材料中，只有兩個(gè)形成了小孢子胚，胚胎誘導(dǎo)成功率為40%。不同基因型的小孢子胚誘導(dǎo)成功頻率存在差異，11J-52每花蕾平均產(chǎn)胚數(shù)達(dá)到2.1個(gè)，而11J-63僅有0.5個(gè)。在未出胚的3個(gè)基因型中，11J-150和11J-158都觀察到了細(xì)胞膨大，11J-173觀察到了細(xì)胞分裂，說(shuō)明它們對(duì)培養(yǎng)條件產(chǎn)生了反應(yīng)，但卻未能繼續(xù)發(fā)育。由此可見(jiàn)，基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)育有明顯影響。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和開(kāi)花期存在分離情況見(jiàn)圖2。11J-52和11J-63兩種材料均未采用任何加倍處理，兩份材料產(chǎn)生的再生植株只有少部分植株不能表現(xiàn)出十字形花冠，而呈現(xiàn)出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交結(jié)角。

3 結(jié)論與討論

利用小孢子培養(yǎng)不僅能夠快速有效地獲得純系植株，加快青花菜的育種進(jìn)程，而且利用單倍體植株的突變來(lái)篩選抗病、抗旱、抗蟲(chóng)的青花菜植株顯得更加便捷[9]。

基因型是制約小孢子發(fā)育的重要因素[10]。在相同的試驗(yàn)條件下，不同基因型誘導(dǎo)小孢子發(fā)育的頻率差異很大，本研究中，基因型11J-52達(dá)2.1個(gè)，而11J-63則僅有0.5個(gè)，其他3個(gè)基因型（11J-150，11J-158，11J-173）則只有細(xì)胞膨大和部分細(xì)胞分裂，這個(gè)結(jié)果可以為青花菜游離小孢子培養(yǎng)提供理論依據(jù)。但是，關(guān)于小孢子培養(yǎng)的啟動(dòng)機(jī)制、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的研究仍在探究過(guò)程中。

本試驗(yàn)中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高溫?zé)峒た梢詥?dòng)小孢子分化，但是，熱激又會(huì)對(duì)小孢子造成一定的傷害，這與一些研究者得出的結(jié)果相類(lèi)似[11]，如何克服這一傷害，找出最適宜的高溫預(yù)處理方式、處理時(shí)間與溫度以增加出胚率還有待進(jìn)一步研究。此外，本試驗(yàn)獲得的再生植株均通過(guò)自然加倍所得，其可能是單倍體、多倍體及非整倍體構(gòu)成的混合群體。試驗(yàn)中觀察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍體。通過(guò)小孢子胚產(chǎn)生的再生植株在農(nóng)藝性狀上的差別與植株倍性之間的聯(lián)系還有待研究。

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[8] 趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（6）：65-68.

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[11] 陸瑞菊，王亦菲，孫月芳，等.提高青花菜游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（2）：1-4.

由表1可以看出，供試的5個(gè)材料中，只有兩個(gè)形成了小孢子胚，胚胎誘導(dǎo)成功率為40%。不同基因型的小孢子胚誘導(dǎo)成功頻率存在差異，11J-52每花蕾平均產(chǎn)胚數(shù)達(dá)到2.1個(gè)，而11J-63僅有0.5個(gè)。在未出胚的3個(gè)基因型中，11J-150和11J-158都觀察到了細(xì)胞膨大，11J-173觀察到了細(xì)胞分裂，說(shuō)明它們對(duì)培養(yǎng)條件產(chǎn)生了反應(yīng)，但卻未能繼續(xù)發(fā)育。由此可見(jiàn)，基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)育有明顯影響。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和開(kāi)花期存在分離情況見(jiàn)圖2。11J-52和11J-63兩種材料均未采用任何加倍處理，兩份材料產(chǎn)生的再生植株只有少部分植株不能表現(xiàn)出十字形花冠，而呈現(xiàn)出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交結(jié)角。

3 結(jié)論與討論

利用小孢子培養(yǎng)不僅能夠快速有效地獲得純系植株，加快青花菜的育種進(jìn)程，而且利用單倍體植株的突變來(lái)篩選抗病、抗旱、抗蟲(chóng)的青花菜植株顯得更加便捷[9]。

基因型是制約小孢子發(fā)育的重要因素[10]。在相同的試驗(yàn)條件下，不同基因型誘導(dǎo)小孢子發(fā)育的頻率差異很大，本研究中，基因型11J-52達(dá)2.1個(gè)，而11J-63則僅有0.5個(gè)，其他3個(gè)基因型（11J-150，11J-158，11J-173）則只有細(xì)胞膨大和部分細(xì)胞分裂，這個(gè)結(jié)果可以為青花菜游離小孢子培養(yǎng)提供理論依據(jù)。但是，關(guān)于小孢子培養(yǎng)的啟動(dòng)機(jī)制、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的研究仍在探究過(guò)程中。

本試驗(yàn)中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高溫?zé)峒た梢詥?dòng)小孢子分化，但是，熱激又會(huì)對(duì)小孢子造成一定的傷害，這與一些研究者得出的結(jié)果相類(lèi)似[11]，如何克服這一傷害，找出最適宜的高溫預(yù)處理方式、處理時(shí)間與溫度以增加出胚率還有待進(jìn)一步研究。此外，本試驗(yàn)獲得的再生植株均通過(guò)自然加倍所得，其可能是單倍體、多倍體及非整倍體構(gòu)成的混合群體。試驗(yàn)中觀察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍體。通過(guò)小孢子胚產(chǎn)生的再生植株在農(nóng)藝性狀上的差別與植株倍性之間的聯(lián)系還有待研究。

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