α—黑素細胞刺激素對EAE豚鼠外周血單個核細胞分泌IL—4、IFN—γ水平的影響

摘要：目的 通過研究α-黑素細胞刺激素（α-MSH）對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）豚鼠分泌IL-4、IFN-γ水平的影響，探討α-MSH對EAE發病有無保護作用。方法 40只雌性豚鼠分為正常對照組、EAE對照組和EAE高、低劑量治療組。兩治療組自造模前7 d始分別按1 mg/Kg/d及0.25 mg/Kg/d予腹腔注射注射α-MSH直至試驗結束。觀察豚鼠神經功能障礙評分變化，測定IL-4、IFN-γ水平。結果 ①α- MSH治療組神經功能障礙評分較EAE對照組顯著降低（P<0.01，P<0.05），高劑量治療組改變更明顯（P<0.05）。②a-MSH治療組分泌IFN-γ水平較EAE對照組降低（P<0.01，P<0.01），分泌IL-4水平較EAE對照組升高（P<0.01，P<0.01）；a-MSH高劑量治療組比低劑量治療組升高或降低更明顯。③各組IFN-γ/IL-4比值與與神經功能障礙評分呈正相關（P<0.01）。結論 α-MSH對EAE豚鼠發病具有保護作用，其作用機制之一可能是通過劑量依賴性地調節IFN-γ/IL-4平衡發揮調節作用的。

關鍵詞：α-黑素細胞刺激素；腦脊髓炎；實驗性自身免疫性；白細胞介素-4；γ-干擾素

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是經典的多發性硬化動物模型。目前研究認為EAE發病機制免疫失衡有關，Th1型細胞因子-γ干擾素（IFN-γ）與Th2型細胞因子白細胞介素-4（IL-4）在其發生發展過程中起著重要的作用[1]。

α-黑素細胞刺激素（Alpha-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH） 是一種前阿片促皮質激素原（Proopiomelanocortin，POMC）衍生肽，一系列動物實驗表明α-MSH對皮炎、炎癥性腸病、支氣管哮喘等多種炎癥性疾病具有治療作用[2-3]，但國內尚無用于EAE和MS的相關報道。本研究試圖通過觀察α-MSH對EAE神經功能障礙評分及相關細胞因子的影響，探討EAE發病及α-MSH治療EAE的機制。

1資料與方法

1.1實驗動物及主要實驗試劑 250～300 g雌性健康豚鼠40只和健康SD大鼠5只； 福氏完全佐劑（complete Freud's adjuvant，CFA）、α-MSH、鼠IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒；淋巴細胞分離液[比重（1.07土0.002）g/mL]等。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 40只雌性豚鼠隨機分為4組，正常對照組、EAE對照組、EAE低劑量治療組、EAE高劑量治療組，每組各10只。取SD大鼠脊髓制成脊髓冰生理鹽水勻漿，再與等量福氏完全佐劑混合，反復抽打制成粗制髓鞘堿性蛋白（crude myelin basic protein，cMBP），將其注入需造模豚鼠雙側后足掌皮下各0.3 mL制造EAE模型。用PBS液稀釋α-MSH成0.25 mg/mL、1 mg/mL兩種濃度的溶液，EAE低、高劑量治療組自造模前7 d始分別予腹腔注射注射α-MSH；EAE對照組及正常對照組分別同時腹腔注射等體積PBS液和生理鹽水，直至實驗終止。造模成功后，每天同一時間對豚鼠進行神經功能障礙評分。評分標準：無明顯異常0分，后肢輕癱1分，后肢完全癱瘓2分，后肢全癱伴前肢不完全癱瘓3分，四肢完全癱瘓或死亡為4分。各EAE組動物均造模成功，觀察3 d癥狀不再加重為發病高峰期處死動物；正常對照組動物4 w后處死。

1.2.2 IFN-γ、IL-4水平的測定 將肝素抗凝的眶靜脈血分離單個核細胞，調成2×106/mL的濃度，用RPMI-1640培養液懸浮，在上述淋巴細胞懸液中加入1mg/ml的PHA，充分混勻后加入24孔培養板中，然后置于5%的CO2，37℃的細胞培養箱中培養6 h，ELlSA法檢測IFN-γ、IL-4水平（按說明書方法進行檢測）。

1.3統計學處理 采用SPSS15.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，進行單因素方差分析；組間兩兩比較用LSD法；變量間相互關系采用Pearson直線相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1神經功能障礙評分 各造模組均有不同程度發病，正常對照組豚鼠未發病。EAE對照組（3.4±0.6）分，EAE低劑量治療組（2.7±0.7）分，高劑量治療組（2.1±0.6）分，兩治療組神經功能障礙評分低于EAE對照組（P<0.05，P<0.01）。EAE高劑量治療組評分低于低劑量治療組（P<0.05）。

2.2各組豚鼠外周血單個核細胞分泌 IFN-γ、IL-4水平的比較，見表1。

2.3 EAE對照組及高、低劑量治療組發病高峰期IFN-γ/IL-4比值與神經功能障礙評分相關性分析 EAE對照組及兩治療組發病高峰期外周血IFN-γ/IL-4比值與神經功能障礙評分呈正相關（r=0.89，P<0.01、r=0.89，P<0.01、r=0.81，P<0.01）。

3討論

Th1細胞主要參與細胞免疫，介導與細胞毒性和遲發型超敏反應有關的免疫應答；Th2細胞主要參與體液免疫應答。Th1細胞分泌的主要細胞因子有IL-2、INF-γ和腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等，這些細胞因子能夠觸發細胞免疫，使炎性細胞轉移至CNS內從而加劇髓鞘破壞過程；Th2細胞則主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，具有抗炎作用，因而認為MS是Th1介導的細胞免疫為主的疾病[1]。正常情況下，Th1和Th2細胞及其分泌的細胞因子處于動態平衡中，并受到機體的嚴格調控，各種原因導致Th1/Th2細胞因子失衡可導致自身免疫性疾病（如多發性硬化，類風濕性關節炎）的發生[4-6]。

本實驗中，通過對EAE豚鼠外周血中最具代表性的Th1、Th2型細胞因子IFN-γ及IL-4的檢測，結果發現在發病高峰期，EAE對照組豚鼠外周血單個核細胞分泌IFN-γ水平比正常對照組顯著增高（P<0.01），分泌IL-4的水平較正常組顯著降低（P<0.01）。進一步相關分析結顯示：IFN-γ/IL-4比值與EAE豚鼠神經功能障礙評分呈正相關。本實驗證實了EAE體內存在Th1/Th2細胞免疫失衡，即Th1細胞過度活化，Th2細胞功能受抑制，Th細胞分化向Th1極偏移，且失衡程度與神經功能障礙的嚴重程度相關。

多種肽類激素具有一定免疫保護作用，而α-MSH是一種POMC衍生肽，其受體分布廣泛，除黑色素細胞外還分布于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞，表明α-MSH應該對機體免疫功能有一定影響。研究發現α-MSH可以減輕棒狀桿菌和脂多糖誘導的肝炎的炎性強度；抑制接觸型皮炎的激發，引起特異的半抗原耐受；對支氣管哮喘、脈管炎、炎癥性腸病等多種免疫性疾病具有抑制發生或減輕損害作用[2-3]。本實驗結果顯示，α-MSH能夠減輕EAE豚鼠發病高峰期神經功能障礙評分，說明α-MSH對EAE發病具有一定保護作用，通過進一步測定Th1、Th2型相關細胞因子發現α-MSH能夠劑量依賴性地減少EAE豚鼠發病高峰期PBMC的IFN-γ分泌水平，增加分泌IL-4分泌，表明調節Th1/Th2細胞平衡可能是α-MSH發揮其免疫保護作用的靶點之一，即通過抑制Th1細胞的增殖分化，促進Th2細胞的功能來達到防治EAE發生發展的作用。我們的結果也與Taylor[7]等的報道一致，即α-MSH可通過促進效應性T細胞極化方向的改變達到免疫調節作用。

目前尚無理想的藥物來阻止MS病情進展，其它免疫治療藥物因費用昂貴及毒副作用大等原因難以推廣，而α-MSH及其衍生物毒性低，副作用輕微，有良好的依從性，并且免疫調節作用強而廣泛，無明顯不良反應[9-11]，具有潛在的臨床應用前景。

參考文獻：

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