鎘暴露對食蚊魚生長發育的影響

摘 要：為研究鎘暴露對食蚊魚生長發育的影響，將性成熟的雌、雄魚各50尾，分別靜水暴露于4個鎘濃度（5，20，100，500 nmol·L-1）試驗組中，分別在3，5，8周后取樣，對其體長、體質量、肝臟質量和性腺質量進行檢測，計算肝腺指數、性腺指數，統計雌魚不同發育時期的胚胎數，檢測雄魚的精子密度及精子活力等。結果顯示，高濃度鎘暴露，雄性食蚊魚的體長、體質量、肝質量、性腺質量等與對照組相比，有明顯差異（P<0.01），精子活力與精子數量也明顯下降；相對而言，雌性食蚊魚的生長發育與對照組相比，差別不明顯（P<0.05）。結果表明，鎘對食蚊魚具有環境雌激素的生物學效應，鎘對雌性食蚊魚的影響主要是集中在較早的胚胎發育時期。

關鍵詞：鎘；靜水暴露；生長；胚胎發育；食蚊魚

中圖分類號：O614.24+2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.001

20世紀以來，工業快速發展，鎘（Cadmium， Cd）的產量逐年增加。相當數量的鎘通過廢氣、廢水、廢渣排入水環境，造成污染。污染源主要是鉛鋅礦，以及有色金屬冶煉、電鍍和用鎘化合物作原料或觸媒的工廠。鎘的污染主要有氣型和水型兩種。氣型污染主要來自工業廢氣，鎘隨廢氣擴散到工廠周圍并自然沉降，蓄集于工廠周圍的土壤中，可使土壤中的鎘濃度達到40 μmol·L-1，污染范圍有的可達數公里。水型污染主要是鉛鋅礦的選礦廢水和有關工業（電鍍、堿性電池等）廢水排入地面水或滲入地下水引起[1]。鎘作為一種非降解且有蓄積性的污染物，因其毒性大、應用廣泛而成為主要的重金屬污染物。在低濃度鎘水環境中暴露即可對魚類產生毒性效應及其他生物學效應，導致魚類各組織器官出現損害，從而對其生長發育及生殖造成影響。由于鎘的毒性累積，水生動物的鎘含量也日漸增加。人食用含鎘的魚類或植物時，鎘便會通過食物鏈進入人體。人攝入鎘被人體吸收后，排出非常緩慢，在人體的生物半衰期很長，約為16～38年[2-3]。鎘在人體的腎和肝臟中蓄積，造成積累性中毒，可能引發癌癥。

近年來，水污染問題已受到廣泛的關注。魚類生活于水中，通過魚類的多樣性和種群變化情況可以推斷水環境狀況，即利用魚類監測水質的變化，所以魚類是水域污染的活的“監測器”。評價水污染的程度，急性毒性的數據與資料是最為常用的依據之一，然而污染物質對水生生物的潛在危害往往是有毒物質低濃度長時間的暴露。由于慢性毒性試驗周期長、耗資大，如何縮短試驗周期就成為人們關注的問題。一些研究發現胚胎和幼魚是魚類最敏感的生活階段，在20世紀70年代末提出了早期生活階段試驗，然而進行早期生活階段試驗仍需30～90 d[4-5]。為進一步探索縮短試驗周期方法，有學者發展了黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）7 d亞慢性試驗[6]，ISO提出了短期早期生活階段試驗[7]。用魚類早期發育階段試驗的結果來預報化學物質對魚類可能產生的影響，這樣就大大縮短了試驗的持續時間，為評價化學物質對魚類的影響提供了比較快速的試驗方法。

西部食蚊魚（Gambusia affinis）是一種小型卵胎生魚類，為了消除蚊子和瘧疾，于19世紀初便從北美和中部美洲引入到世界各地。食蚊魚的入侵性非常強，并具有高繁殖力，對其所在的生態系統具有關鍵的生物效應。這個物種對溫度和鹽度的變化有較強的適應能力，這使其能在不同的生態環境中存活。由于以上的特性，食蚊魚廣泛分布于各地，容易捕撈，易于在實驗室進行毒性暴露試驗，因此被廣泛用于生物指示種類。本課題利用食蚊魚作為試驗動物，在實驗室條件下，將其暴露于不同濃度的鎘水環境中，通過在試驗期間檢測到的食蚊魚的體長、體質量、性腺（卵巢和精巢）等一系列指標作為生殖發育的重點指標。在個體的水平上，研究不同濃度的鎘溶液對食蚊魚生長和胚胎發育的影響，為環保部門提供有科學價值的基礎數據和資料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

食蚊魚購買于廣州市花地灣花鳥市場，挑選性成熟的食蚊魚，并將雄魚與雌魚進行分別鑒定：雄魚平均體長35 mm，具有生殖鰭（交配足），且鰭上具鉤的為性成熟的雄魚個體；雌魚體長35～60 mm，無生殖鰭結構。將選好的性成熟雄魚與雌魚分別放在玻璃水缸里馴養3～4周，定時喂食。馴養完成后，將一定數量的雄魚與雌魚置于不同濃度的鎘靜水環境中，定時喂食。每隔一段時間，觀察食蚊魚的生長狀況并測量其生殖指標。

1.2 試驗藥品和儀器

KCL溶液、臺盼藍染色液等。玻璃魚缸、網罩、氣泵各5個，漁網和備用魚缸。標準刻度尺、解剖鏡、解剖針、解剖盤和分析天平。電子顯微鏡、血球計數板、移液槍和PCR管、冰盒、鑷子、玻片和記號筆等。

1.3 試驗條件

試驗用水為曝氣24 h的自來水。養殖和暴露期間的條件控制：水溫25～28 °C，試驗期間每天分別在9：00、18：00各投喂1次剪碎的紅蟲（Tendipes sp.larvae），每次投喂1 h后清除殘餌，3 d換水1/3。

1.4 試驗方法與步驟

1.4.1 鎘暴露對食蚊魚生長和胚胎發育的影響 選用性成熟的雌、雄食蚊魚各250尾，雌、雄食蚊魚相隔離，先置室內馴養3～4周后進行鎘暴露試驗，暴露周期分別持續5周和8周。暴露試驗分組設定：（1）不加鎘的半靜水對照組；（2）鎘試驗組，設定5，20，100，500 nmol·L-1共4組，每組試驗魚50尾，用15 L的水進行養殖。半靜水暴露，每組濃度梯度和飼養條件完全一致。每隔3 d換掉1/3半靜水，并加鎘使之保持設置的濃度，使用原子吸收分光光度計（Z-2000）進行監測。在暴露期間，于第3周、5周和8周后隨機選取雌、雄魚各6條進行解剖。在解剖前測量魚的全長、體質量，剖后測量肝臟質量和性腺質量，計算肝腺指數和性腺指數，并制作石蠟切片對雌魚的卵巢進行組織學觀察。根據食蚊魚胚胎發育12個時期進行胚胎數量的統計，測定雄魚的精子數量和精子活力。

1.4.2 雌魚繁殖體鑒別與統計 解剖雌魚，取出完整的卵巢，在體式顯微鏡下用解剖針解剖觀察，進行食蚊魚的胚胎發育時期劃分。參照Edward[8]對食蚊魚胚胎發育分期的描述，將食蚊魚胚胎發育劃分為12個階段：Stage0：卵細胞處于生殖靜止期；Stage1～Stage2：卵細胞開始積累卵黃顆粒；Stage3：第1次出現所有的卵大小一致的狀況；Stag4：囊胚出現透明點；Stage5：胚胎延長，但未出現色素；Stage6：開始出現眼睛的黑色素；Stage7：體積變大，眼睛明顯但尚未發育完全；Stage8：胚胎開始出現發育完全和色素充足的眼睛、皮膚，但是尾巴還沒有和頭部分開；Stage9：胚胎依然保留巨大的卵黃囊，但是尾巴已經和頭部分開；Stage10：卵黃已經被吸收，若此時的胚胎離開母體，已經具備生存能力；Stage11：卵黃被吸收，準備離開母體。統計雌魚各個時期的胚胎數，將其記錄下來。

1.4.3 測定雄魚的精子數量 精莢的獲?。簭慕馄实聂~體中取出性腺，放在干凈的培養皿中，用鑷子破碎取出精莢，然后用2.5 μL的移液槍迅速吸入成熟的精莢，在吸入精莢之前須知道吸入的精莢精確數目，將吸取的精莢放入PCR管（每個濃度3個重復），并加入KCl使之體系增加到50 μL，此時用移液槍反復吸打20次，使精莢破裂并充分混合。

數量的統計：從PCR管中吸取1 μL液體，滴在血球計數板的格子部位，蓋上蓋玻片開始計數。將顯微鏡下看到的血球計數板的上、下、左、右、中5大方格子里的精子數目記錄下來。

精子數量的計算公式為：

由此公式求得樣品平均每個精莢中所含精子數量。

1.4.4 精子活力統計 取定量的成熟精子，置于PCR管中，加入臺盼藍染液使之濃度達到0.5%。染色10 min后，用移液槍吸取1 mL懸液滴在載玻片上。蓋上蓋玻片，在顯微鏡下根據染色結果進行統計。被臺盼藍染成藍色的是死精子細胞，通過計算活細胞/總細胞數目可評價精子的活力。

1.4.5 數據統計與分析 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行各種檢驗和比較。采用獨立樣品T檢驗進行數據顯著性差異分析。當P<0.05時，認為差異顯著；當P<0.01時，認為差異極為顯著。

2 結果與分析

2.1 鎘暴露對性成熟雄性食蚊魚生長及生殖發育的影響

由表1可見，不同濃度的鎘暴露3周和5周后對雄性食蚊魚的生長和發育有不同程度的影響。

鎘暴露3周后，低濃度組（5 nmol·L-1）與對照組相比，體質量、肝質量、精子數量有明顯差異（P<0.05），其它指標無差異；較低濃度組（20 nmol·L-1）體質量、體長、肝質量和肝腺指數均無差異，但性腺質量、性腺指數、精子數量、精子成活率均出現明顯差異（P<0.05，P<0.01），尤其是雄魚的精子成活率有顯著差異（P<0.01）；較高濃度組（100 nmol·L-1）體長、體質量、肝腺指數、性腺指數、精子數量與對照組相比無差異（P<0.05），而肝質量、性腺、精子成活率有顯著差異（P<0.05，P<0.01）；高濃度組體質量、性腺質量、性腺指數均出現明顯差異（P<0.05）。暴露5周后，鎘對雄性食蚊魚的影響比暴露3周的影響要大一些。從表中數據來看，雄性食蚊魚的體長、體質量、性腺質量、精子數量、精子成活率均有所下降，且下降的幅度要比3周的大，而肝質量與肝腺指數有所增大。由以上數據可看出，經鎘暴露后，5～100 nmol·L-1的鎘半靜水環境對性成熟雄性食蚊魚的生長影響較??；高濃度的鎘半靜水環境對性成熟雄性食蚊魚的體質量、性腺影響較大，也影響到雄魚的生殖力。在所有測量指標中，雄性食蚊魚的精子成活率對鎘水環境的濃度最為敏感。在濃度為20 nmol·L-1時，精子活力已經出現明顯下降的現象。

2.2 鎘暴露對性成熟雌性食蚊魚生長及生殖發育的影響

由表2可見，不同濃度的鎘暴露對雌性食蚊魚的生長和生殖發育有不同程度的影響。

與對照組相比，低濃度組（5 nmol·L-1）的體長、體質量、肝質量、性腺質量、肝腺指數都有明顯下降的現象，性腺指數稍有上升；從其他濃度組來看，雌性食蚊魚的各項指標隨著鎘濃度的增大變化更趨明顯，尤其是高濃度的鎘極明顯地損傷了雌魚的生長機制和生殖系統，性腺質量大大減小。

2.3 鎘暴露對雌性食蚊魚胚胎發育的影響

由圖1 A、B和C可見，鎘暴露3、5和8周后對雌性食蚊魚的胚胎發育影響相一致，表現為對其早期階段的胚胎發育影響較明顯，并且隨著鎘濃度的增加，0～3期胚胎數減少的情況比較顯著（P<0.05）。而越到胚胎發育的后期，鎘對食蚊魚胚胎的傷害就越小。在胚胎發育的后期，試驗組與對照組的胚胎數無明顯差異，都維持在較穩定的水平上。這些數據皆表明，鎘對雌性食蚊魚胚胎發育的影響，主要集中在對食蚊魚早期胚胎發育時期的損害上，而中晚期胚胎的防御能力增強，能夠抵抗一定程度的鎘毒害作用。

3 結論與討論

隨鎘濃度的增大，鎘對性成熟的食蚊魚生長發育的影響更加明顯。在高濃度的鎘半靜水環境中，雄性食蚊魚的體長、體質量、肝質量、性腺質量等與對照組相比，有明顯差異，主要表現為體長減小、體質量減輕、肝質量增大、性腺質量減小，而雄性食蚊魚的精子活力與精子數量也明顯下降。隨著時間的推移，這種差異的程度更加顯著，在試驗的第8周時，雄性食蚊魚全部死亡。相對雄性而言，雌性食蚊魚的生長發育與對照組相比，差別不明顯。結果表明，鎘具有環境雌激素的生物效應，對雄性食蚊魚的影響比雌性食蚊魚更加明顯；鎘對雌性食蚊魚胚胎發育的影響主要是集中在較早的胚胎發育時期，中晚期的胚胎發育則比較穩定。

3.1 鎘對魚類生長發育的影響

與對照組相比，無論是雄性食蚊魚還是雌性食蚊魚，通過5周或8周的暴露試驗，其體長、體質量均明顯減輕。這是因為鎘能夠影響食蚊魚體內的消化酶活性，其機制可能為：重金屬離子直接與消化酶活性中心上的咪唑基、巰基、氨基等功能集團結合，抑制酶的活性，或酶的非活性中心部分與重金屬離子結合，使結構發生改變，酶活性減弱[9]。

肝臟是動物體內的主要解毒器官，也是污染物蓄積和產生毒害作用的主要靶器官之一。當魚體暴露于有毒的水環境中，由于氧化脅迫的作用，肝臟等組織器官將通過抗氧化系統酶活性的誘導去進行自身的保護，某些代謝酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等可能被誘導或抑制，進而導致代謝物在肝細胞內積累，將可能引起魚體的肝細胞腫大、肝腺指數（HIS）升高[10]，本研究結果也證明了這一點，經過5～8周鎘暴露，雌雄魚肝質量有不同程度增加。

3.2 鎘對雄性食蚊魚性腺發育的影響

鎘半靜水環境對雄性食蚊魚的性腺發育造成一定程度的損傷，高濃度的鎘半靜水暴露還會使得雄性性腺萎縮，生殖力下降。在試驗過程中，雄性食蚊魚比例不斷減少，在高濃度的鎘半靜水環境中尤為明顯。這是因為鎘還具有環境雌激素及環境內分泌干擾物質的效應[11-12]，它通過直接或間接作用于某些重要基因如癌基因或抑癌基因，以及細胞中其他的信號途徑如離子通道、細胞第二信使系統等方面而起作用。這種鎘的類雌激素作用可以干擾雄性激素水平，有效地影響雄性食蚊魚的生長和發育。由于雄性食蚊魚的性腺發育受抑制，其能量就會儲存在肝臟和肌肉中，這使肝臟有更多的能量用于自身的解毒和修復[13]。性腺發育受到抑制，體內相關的激素水平也會降低，從而造成精子數量和精子活力的下降[14]。

3.3 鎘對雌性食蚊魚性腺發育和胚胎發育的影響

鎘具類雌激素活性作用，能夠誘導食蚊魚胚胎凋亡，使胚胎產生畸形。鎘在魚體內累積，因身體各部位代謝功能不同，其主要累積在內臟部位，其中肝臟和性腺尤為明顯。鎘對雌性食蚊魚的肝臟和性腺的影響不如對雄性食蚊魚的強烈。在魚類的整個生活周期中，胚胎期和幼魚早期發育階段對重金屬鎘污染最為敏感。鎘作為一種環境雌激素，可以模擬性激素的作用，與體內相應受體結合，從而激活受體引發相應的生物效應，或阻斷以及減少體內性激素的受體結合力和生物活性。因此，鎘能夠干擾魚體內的內分泌水平，能與含羧基、氨基特別是含巰基的蛋白質分子結合，如與組織蛋白羧基形成不溶性金屬蛋白鹽，與巰基形成穩定的金屬硫醇鹽，導致許多酶系統的活性受到抑制和破壞，喪失了酶系正常生理功能[15]。此外，鎘還會對胚胎產生一定的毒害作用，可能引起胚胎內的染色體畸形或者對胚胎細胞的直接毒害。胚胎的每一發育時期，其承受能力也是一定的，一旦超過安全濃度，胚胎便可能發生凋亡現象。胚胎發育時期越早，這種毒害作用越明顯。

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