酶聯免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用

摘要：介紹了酶聯免疫吸附分析方法的原理、類型以及在獸藥殘留檢測中的關鍵技術環節和國內外應用現狀，討論了酶聯免疫吸附分析技術應用于獸藥殘留檢測所存在的問題和發展前景。

關鍵詞：酶聯免疫分析；獸藥殘留；應用

中圖分類號：S859.84 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）10-0059-03

獸藥殘留不僅直接對人體產生急慢性毒性作用，引起細菌耐藥性的增加，還通過環境和食物鏈的作用對人體健康造成潛在危害。加強獸藥管理和獸藥殘留分析是控制獸藥殘留的重要手段。獸藥殘留的分析方法一般有免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等。其中，免疫分析法具有高度的選擇性和靈敏度、分析過程簡化等優點，有很大的發展前景[1]。酶聯免疫吸附分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是將免疫技術與現代測試手段相結合而建立的一種超微量的測定技術，目前已廣泛應用于臨床醫學、獸醫學、生物學等領域。ELISA檢測技術具有操作簡單、前處理簡化、檢測快速、準確、敏感、成本低、容量大，并可同時進行大批量樣品檢測等優點，這種學科交叉技術正逐漸成為獸藥殘留檢測的一個熱點。

1 獸藥殘留ELISA檢測技術的概述

ELISA是在熒光免疫和放射免疫分析的基礎上發展起來的，是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合起來的一種檢測技術，采用現代光學分析儀器進行光度測定。測定時用固相載體吸附抗體（抗原），加待測抗原（抗體），再與相應的酶標記抗體（抗原）進行抗原抗體的特異免疫反應，生成抗體（抗原）-待測抗原（抗體）-酶標記抗體（抗原）的復合物，最后再與該酶的底物發生反應，生成有色產物，待測抗原（抗體）的定量與有色產物量成正比，因此可根據吸光值計算抗原或抗體的量，不僅可以定性分析而且可以進行定量分析。

ELISA方法是用酶標記抗原、半抗原或抗體而建立的方法，其分類至今無統一的標準，常用的方法有：雙抗體夾心法測抗原、酶標抗原直接競爭抑制法、酶標抗體直接競爭抑制法、酶標抗體間接競爭抑制法。在獸藥殘留檢測中一般采用間接法測抗體效價，評價抗體質量，用競爭法測定樣品中獸藥殘留量，其中酶標抗體間接競爭抑制法有商品化的酶標二抗，無需自己制備，而被廣泛采用。

2 ELISA應用的關鍵環節技術

2.1 免疫抗原的合成

抗原是指一種能刺激人或動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞，并能與這些產物在體內或體外發生特異性反應的物質。抗原的基本能力是免疫原性和反應原性。免疫原性又稱為抗原性，是指能夠刺激機體形成特異抗體或致敏淋巴細胞的能力。反應原性是指能與由它刺激所產生的抗體或致敏淋巴細胞發生特異性反應。具備免疫原性和反應原性兩種能力的物質稱為完全抗原。只具有反應原性而沒有免疫原性的物質，稱為半抗原。半抗原沒有免疫原性，不會引起免疫反應。但在某些特殊情況下，如果半抗原和大分子蛋白質結合以后，就獲得了免疫原性而變成完全抗原，也就可以刺激免疫系統產生抗體和效應細胞。

抗原的免疫原性與分子量直接相關。一般分子量越大、分子結構越復雜則免疫原性越強。獸藥大多是小分子物質，屬于半抗原，因此通常要與分子量較大的載體（一般為蛋白質）偶聯，形成獸藥——載體蛋白結合物免疫原，即形成完全抗原。相同大小的分子，如果化學組成、分子結構和空間構象不同，其免疫原性也有差異。一般來說，分子結構和空間構象愈復雜的物質免疫原性愈強。所以，免疫半抗原的結構是否合理，關系到能否制備穩定并有良好免疫原性的人工免疫原，也是獸藥殘留ELISA方法建立的重要環節。理想的免疫半抗原一方面應盡量具備與待測物有類似的化學特征，另一方面與載體連接后應盡量保證該特征結構最大程度地被免疫活性細胞識別和結合，以制備出具有預期選擇性和親和性的抗體。有些待測獸藥殘留物可直接作為免疫半抗原，與載體偶聯，但對多數不具備活性基團的獸藥可進行衍生化制備或由原料合成，也可用其他代謝及降解產物作為免疫半抗原。

完全抗原的制備是將免疫半抗原活化后，在偶聯劑作用下與載體蛋白偶聯。常用的載體蛋白質有牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔血藍蛋白（KLH）、人血清蛋白（HAS）、結核桿菌毒素蛋白（TT）、多聚賴氨酸（PLL）。目前，用的最多的是BSA，因為其物化性質穩定、不易變性、價廉易得，而且賴氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH和離子強度下均有較大的溶解度，在含有有機溶劑（如吡啶、N，N-二甲基甲酰胺）情況下均可和免疫半抗原進行偶聯，且在偶聯后仍保持可溶狀態[2]。

有時為了提高抗體效價和特異性，通常需要在半抗原與載體間引入一定長度的間隔分子（又稱“間隔臂”），目前大多數學者認為，較適宜的間隔臂長度為4～6個碳鏈長度（0.5～0.8 nm），能較好的突出與載體結合后抗原分子表面上具有特征立體結構和免疫活性的化學基團即抗原決定簇。間隔臂應是不會改變半抗原的電子分布的吸電子基團或雜環，應為非極性，除供偶聯的活性基團外不應有其他高免疫活性的結構，以減少抗體對間隔臂的識別[3]。

2.3 獸藥抗體的制備

一般可采用兩種途徑產生抗體：一是多克隆抗體技術，二是雜交瘤單克隆抗體技術。多克隆抗體可用獸藥-載體蛋白結合物直接免疫兔子等動物，從被免疫的動物血清中獲得，這種抗體不均一，來源間斷，有較大的批間差別，但用于免疫分析效果良好，技術成熟，目前絕大多數獸藥免疫分析仍采用多克隆抗體。單克隆抗體應用于獸藥殘留分析的研究是從20世紀90年代開始的，近20年的發展國內外已制備出十幾種獸藥的單克隆抗體，其中一些已應用于獸藥殘留檢測技術中[4]。單克隆抗體技術雖然生產成本高，技術復雜，但其特異性高，交叉反應少，可大批量生產，成為獸藥殘留ELISA檢測技術的發展趨勢。

2.4 樣品的前處理

酶聯免疫吸附分析具有高選擇性、高靈敏度，一般僅需要簡單提取，可使用稀釋樣品或提取液的方式減少基質干擾。樣品提取溶劑需考慮其對免疫反應和酶活性的影響，一般認為，免疫分析的樣品溶液不能含有非水溶性溶劑，因為其形成的非均相介質可干擾待測物自由擴散或干擾與抗體結合。但也有人認為，反應介質中適量水溶性有機溶劑存在，如甲醇、丙酮、二甲亞砜等，不僅可以簡化操作，而且能增加脂溶性獸藥在介質中溶解，降低其在實驗器皿表面的吸附損失和破壞樣品基質的親脂性膠束[5]。

3 ELISA檢測技術在獸藥殘留分析中的應用

隨著小分子化合物免疫分析技術的發展，目前幾乎所有常見的獸藥殘留都已建立了ELISA檢測方法，檢測樣本多樣，主要有動物組織（包括肌肉、肝臟、腎臟等）、蛋、乳、蜂蜜、飼料、尿液、毛發等。獸藥種類繁多，按用途分類主要包括：抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲藥、殺蟲劑和促生長劑，抗生素和合成抗菌素合稱抗微生物藥物，是最主要的獸藥殘留藥物，約占60%[6-10]。表1列出了近3年（2010至2013年）國內外有關抗微生物類獸藥殘留ELISA檢測方法的檢測樣本、檢測限和獸藥種類等情況。

4 問題和展望

獸藥殘留的酶聯免疫分析技術經過幾十年的發展，已經取得了可喜進展，但由于獸藥種類繁多、結構復雜、檢測樣本各異，該技術的研究和開發應用仍存在很多尚待解決的問題，如人工免疫抗原的合成、免疫反應的特異性和抗體的選擇性、方法的標準化等[11-19]。但免疫分析技術的自身優勢和方法上的不斷完善，尤其是制備更加特異的單克隆抗體或功能更加完備的重組單鏈抗體，以及免疫傳感器技術和芯片技術的日益完善，必將在獸藥殘留快速檢測領域發揮愈來愈重要的作用。

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