p21、p53基因表達(dá)及其單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系

[摘要] 目的 探討肝細(xì)胞肝癌患者p21和p53基因的表達(dá)及其單核苷酸的多態(tài)性，分析其與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系。 方法 選擇50例肝細(xì)胞肝癌患者和50名健康志愿者，采用PCR技術(shù)檢測(cè)兩組外周血白細(xì)胞中的p21和p53基因的表達(dá)情況，采用PCR-RFLP方法檢測(cè)p21 3’UTR位點(diǎn)以及p53 intron 6 位點(diǎn)的基因多態(tài)性。 結(jié)果 肝癌組p21和p53 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P < 0.01）。飲酒能夠增加p53 mRNA的表達(dá)。p21基因3’UTR C/T位點(diǎn)C/T+T/T型與60歲以上人群肝癌患病率升高有關(guān)。 結(jié)論 p21基因以及p53基因的高表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌有一定的相關(guān)性，飲酒能夠使肝癌患者p53基因的表達(dá)升高。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞肝癌；p21；p53；基因表達(dá)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）17-0006-04

肝細(xì)胞肝癌的惡性程度高，嚴(yán)重危害患者的健康和生命，肝細(xì)胞肝癌因起病隱匿、進(jìn)展快、病程短，一旦發(fā)現(xiàn)患者多已經(jīng)進(jìn)入晚期，因此死亡率高，在我國(guó)腫瘤死亡譜中占第二位[1]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，肝癌在診斷、治療等方面有了較大的發(fā)展，但是其死亡率仍然較高，因此研究其發(fā)病機(jī)制，開(kāi)展一、二級(jí)預(yù)防具有重要的意義。p21是腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶[2]，p53是抑癌基因[3]，兩者的突變、基因缺失、遺傳形狀改變均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期異常而發(fā)生惡性腫瘤。本研究分析50例肝細(xì)胞肝癌患者p21、p53基因的表達(dá)情況以及其單核苷酸多態(tài)性，分析其與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

2011～2012年選擇在我院治療的肝細(xì)胞肝癌患者50例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床癥狀、體征、血清肝癌標(biāo)志物、肝組織病理學(xué)活檢等確診為肝細(xì)胞肝癌，不伴其他器官的惡性腫瘤以及肝臟轉(zhuǎn)移，未接受抗癌治療。另選擇50例健康志愿者為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)腫瘤病史、無(wú)遺傳疾病、無(wú)其他系統(tǒng)嚴(yán)重的疾病，按照性別、年齡等一般資料匹配原則進(jìn)行選擇。見(jiàn)表1。

1.2標(biāo)本采集

采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血4 mL于含有0.2 mL抗凝劑的真空抗凝管中，混勻。4 h內(nèi)取2 mL提取總的RNA，剩余的2 mL用于提取基因組DNA。

1.3檢測(cè)方法

分析采用多因素Logistic回歸分析。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝癌危險(xiǎn)因素分布情況

見(jiàn)表2。肝癌組患者HBsAg陽(yáng)性的比例以及有肝癌家族史的比例顯著高于對(duì)照組（P < 0.01）。

2.2 p21和p53 mRNA表達(dá)

見(jiàn)表3。肝癌組p21和p53 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P < 0.01）。

3 討論

肝細(xì)胞肝癌起病隱匿、進(jìn)展快、惡性程度高、病程短、死亡率高，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等是多因素、多基因共同作用的結(jié)果。目前對(duì)肝細(xì)胞癌的研究主要是基因水平上闡述其發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞的正常周期受多個(gè)因素的綜合調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞周期出現(xiàn)異常時(shí)，常常可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。有研究顯示G1/S期相關(guān)的調(diào)控通路發(fā)生異常時(shí)，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的作用[4]。

p21是腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，有研究顯示，當(dāng)p21基因分型突變、表達(dá)缺失以及遺傳性狀改變時(shí)，細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。p21基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員[5]，既與腫瘤抑制作用密切相關(guān)，又能通過(guò)抑制周期素依賴(lài)激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）復(fù)合物活性，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，從而將腫瘤抑制作用與細(xì)胞周期控制過(guò)程緊密相連。p21基因的發(fā)現(xiàn)、克隆及其在細(xì)胞周期控制與腫瘤發(fā)生中有重要作用。p21基因通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶來(lái)控制細(xì)胞從G期進(jìn)入S期，抑制DNA的合成，使細(xì)胞停止分化。當(dāng)p21表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞分化增殖調(diào)控異常，從而可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。p21基因的多態(tài)性與一些惡性腫瘤的易感性有關(guān)。在本研究中，肝癌患者外周白細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，考慮原因可能是肝癌細(xì)胞的DNA受損，p21上調(diào)以修復(fù)受損的DNA。慢性肝炎、肝癌家族史、飲酒、吸煙等是肝癌常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素，在本研究中，p21 mRNA的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、HBV感染、家族史、飲酒、吸煙等因素沒(méi)有明顯的相關(guān)性，說(shuō)明這些常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素并不能使p21表達(dá)上調(diào)，p21基因表達(dá)與肝癌的發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

p53基因因編碼一種分子質(zhì)量為53 kDa的蛋白質(zhì)而得名，是一種抗癌基因。其表達(dá)產(chǎn)物為基因調(diào)節(jié)蛋白（P53蛋白），當(dāng)DNA受到損傷時(shí)表達(dá)產(chǎn)物急劇增加，可抑制細(xì)胞周期進(jìn)一步運(yùn)轉(zhuǎn)[6]。一旦p53基因發(fā)生突變，P53蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制，發(fā)生癌變，人類(lèi)癌癥中約有一半是由于該基因發(fā)生突變失活。在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)（protein）是一種轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor），其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。許多有關(guān)細(xì)胞健康的信號(hào)向P53蛋白發(fā)送。關(guān)于是否開(kāi)始細(xì)胞分裂就由這個(gè)蛋白決定。如果這個(gè)細(xì)胞受損，又不能得到修復(fù)，則P53蛋白將參與啟動(dòng)過(guò)程，使這個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53缺陷的細(xì)胞沒(méi)有這種控制，甚至在不利條件下繼續(xù)分裂。像所有其他腫瘤抑制因子一樣，p53基因在正常情況下對(duì)細(xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。細(xì)胞中抑制癌變的基因“p53”會(huì)判斷DNA變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細(xì)胞自我修復(fù)，若DNA變異較大，“p53”就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。肝癌細(xì)胞中p53基因突變率高達(dá)50%。當(dāng)細(xì)胞DNA受損后，p53的表達(dá)會(huì)急劇升高，從而使細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期，并進(jìn)行修復(fù)，以恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。當(dāng)修復(fù)失敗的時(shí)候，p53就會(huì)促使細(xì)胞凋亡，從而抑制癌癥的發(fā)生。在本研究中肝癌患者p53基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異顯著。這也提示，當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，p53的表達(dá)上調(diào)以發(fā)揮抑制癌癥發(fā)生的作用。對(duì)肝癌患者的臨床資料進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示，患者的年齡、性別、HBV感染、家族史、吸煙等于p53 mRNA的表達(dá)并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，而飲酒可能會(huì)使p53的表達(dá)升高，原因可能是長(zhǎng)期飲酒可導(dǎo)致肝臟的解毒功能下降，機(jī)體免疫力下降，肝細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致p53基因表達(dá)的上調(diào)。

p21對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)通過(guò)兩種途徑實(shí)現(xiàn)，一種是依賴(lài)p53的途徑，一種是非依賴(lài)p53的途徑。本研究的結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞p21基因與p53基因的表達(dá)量沒(méi)有明顯的相關(guān)性。可能的原因是由于p21基因通過(guò)其他的途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性[8]。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。通常所說(shuō)的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換（C←→T，在其互補(bǔ)鏈上則為G←→A），也可能是顛換（C←→A，G←→T，C←→G，A←→T）。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其他幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其他幾種變異的發(fā)生幾率相似。p21基因的單核苷酸多態(tài)性主要是第2外顯子的31密碼子中，C→A，絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼帷４硕鄳B(tài)性位點(diǎn)發(fā)生改變，可導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞G1期的調(diào)控喪失。另一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)是核苷酸出現(xiàn)C→T改變，與mRNA的穩(wěn)定性、細(xì)胞的增殖、腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移有關(guān)。p53有三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)和腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性[9，10]。一個(gè)位點(diǎn)是精氨酸由脯氨酸取代，一個(gè)是第6內(nèi)含子G→A改變，一個(gè)是第三內(nèi)含子的突變。在本研究中，p21 3’UTR C/T位點(diǎn)的C/C、C/T、T/T基因頻率與健康對(duì)照組比較，差異不顯著，校正性別、年齡、家族史、飲酒、吸煙、HBV感染等因素后，回歸分析顯示，與C/C型相比，T/T和C/T基因型與患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，攜帶至少一個(gè)突變等位基因T與肝癌的患病也沒(méi)有相關(guān)性。對(duì)患者按照年齡和性別進(jìn)行進(jìn)一步的分層分析，p21 3’UTR位點(diǎn)的T/T+C/T基因型可增加60歲以上人群肝癌分先。肝癌患者p53基因內(nèi)含子6 G/A位點(diǎn)G/G、G/A、A/A基因型頻率與對(duì)照組比較，差異不顯著。校正年齡、家族史、性別、飲酒、吸煙、HBV感染等相關(guān)因素后，回歸分析顯示，與G/G基因型比較，G/A和A/A基因型與肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有相關(guān)性。攜帶至少一個(gè)突變基因A與肝癌患者患病的風(fēng)險(xiǎn)也沒(méi)有相關(guān)性。這與既往的研究不甚一致。原因可能是既往的研究主要是肺癌，不同的腫瘤對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的敏感程度不同，另外，對(duì)于不同的人群，遺傳性狀也會(huì)不同。

綜上所述，p21基因以及p53基因的高表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌有一定的相關(guān)性，飲酒能夠使肝癌患者p53基因表達(dá)升高，攜帶p21 3’UTR T等位基因可增加60歲以上人群患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。

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（收稿日期：2013-03-27）