黃芪甲苷的提取及抗結(jié)核作用研究

摘要：從黃芪（Radix Astragalus）中提取黃芪甲苷，將其作用于THP-1細胞和THP-1吞噬結(jié)核桿菌菌株H37Rv模型，考察黃芪甲苷促進THP-1吞噬結(jié)核桿菌的效果。結(jié)果表明，黃芪甲苷能強化THP-1細胞活力和其吞噬H37Rv的能力，且試驗范圍內(nèi)黃芪甲苷濃度越高作用效果越強。

關鍵詞：黃芪（Radix Astragalus）甲苷；提取；THP-1；結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）

中圖分類號：R284.2；R285.5；R378.91+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2632-02

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見[1]。目前，結(jié)核病治療主要采用異煙肼等藥物，但存在耐藥性等問題。黃芪（Radix Astragalus）又名黃耆，為豆科植物膜莢黃芪（Astragalus membranaceus）的根，是一種常用中藥，分布于我國內(nèi)蒙古、山西等地區(qū)，具有補氣固表、利水退腫等功效。現(xiàn)代研究表明，黃芪中所含的甲苷、黃酮等成分能夠有效增強機體的免疫功能[2，3]。有報道顯示黃芪能夠強化巨噬細胞活力，幫助人體抵御并殺滅結(jié)核桿菌[4，5]。本研究從黃芪中提取黃芪甲苷，將其作用于THP-1細胞和THP-1吞噬結(jié)核桿菌H37Rv菌株模型，檢驗黃芪甲苷促進巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌的功效，為黃芪活性成分的開發(fā)利用及抗結(jié)核病新藥的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 黃芪購自安國市寶盛中藥材有限公司，保存于河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院材料庫；結(jié)核桿菌H37Rv菌株和THP-1白血病細胞株來自河北醫(yī)科大學生化研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基，青島日水生物技術有限公司；胎牛血清，上海基峰生物有限責任公司；二甲基亞砜，姜堰市奧倫合成樹脂有限公司；聚賴氨酸，蘭州偉日生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器 MZ型高速粉碎機，青島邁科隆粉體技術設備有限公司；360EP電子天平，上海精科天美貿(mào)易有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海一凱儀器設備有限公司；KNF循環(huán)水真空泵，上海誠銘科技有限公司；紫外可見分光光度計，上海天普分析儀器有限公司；BDS200-PH倒置相差顯微鏡，天津西格光電科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱，上海三騰儀器有限公司；LP-160B數(shù)字酸度計，上海厚望科學儀器有限公司；BZY-1恒溫槽，上海衡平儀器儀表廠；FZG真空干燥箱，南京康方機械科技有限公司；DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芪甲苷的提取 將黃芪干燥并粉碎，取150 g黃芪粉末，用1 500 mL體積分數(shù)75%的乙醇在80 ℃加熱回流提取3次，每次加熱回流提取時間分別為48、24、24 h。減壓濃縮得乙醇濃縮液，再經(jīng)85 ℃水浴處理60 min后用石油醚萃取。萃取后得到的溶液加入正丁醇，充分振搖，重復提取5次，合并提取液。加入氨試液25 mL，充分振搖，重復提取3次，獲得黃芪甲苷提取液。

1.2.2 黃芪甲苷含量測定 取黃芪甲苷標準品5.0 mg，加無水乙醇溶解，混勻并定容至10 mL得到黃芪甲苷標準液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL黃芪甲苷標準液，用無水乙醇稀釋至0.5 mL，再加入10%的香蘭素乙醇溶液0.5 mL，經(jīng)冰水浴處理后，加入70%的硫酸定容至10 mL，搖勻。以未添加黃芪甲苷標準液的處理為空白對照，測定其在544 nm波長處的吸光度，得到黃芪甲苷濃度（C//mg/mL）對吸光度（A544 nm）的線性回歸方程為A=0.932C+0.047，相關系數(shù)r=0.988 7。

1.2.3 THP-1細胞的培養(yǎng) THP-1細胞復蘇解凍后，置于含15%小牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為CO2濃度8%、溫度36 ℃。THP-1細胞生長到指數(shù)生長期時調(diào)整細胞濃度為1.5×105 cell/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)基至體積為2 mL，在CO2濃度8%、溫度36 ℃的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.4 黃芪甲苷對THP-1細胞活力影響 將THP-1細胞培養(yǎng)至分化階段，在2 mL培養(yǎng)基中加入25 μL含不同濃度黃芪甲苷（0、0.10、0.25、0.40 mg/mL）的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)36 h，加入25 μL 5 mg/mL的噻唑藍，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，經(jīng)離心處理后，吸去培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)基，各孔中加入160 μL二甲基亞砜，充分振蕩之后測定各孔光密度值（OD），取平均值。

1.2.5 結(jié)核桿菌預處理 取2 mL經(jīng)過滅活處理的H37Rv加入15 mL培養(yǎng)基混勻，控制菌濃度為5×106 CFU/mL。

1.2.6 THP-1細胞吞噬H37Rv模型 取分化到指數(shù)生長期的THP-1細胞，調(diào)整濃度為5×104 cell/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種1 mL，加入丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）10 mL，靜置48 h誘導分化，之后加入1 mL 5×105 CFU/mL的H37Rv，再加入含不同濃度黃芪甲苷（0、0.10、0.2

2.3 黃芪甲苷對THP-1吞噬H37Rv的影響

不同濃度黃芪甲苷對THP-1吞噬H37Rv的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，培養(yǎng)基中添加黃芪甲苷能促進THP-1細胞對結(jié)核桿菌H37Rv的吞噬作用，不同濃度的黃芪甲苷處理后THP-1細胞對H37Rv的吞噬率和吞噬指數(shù)都顯著高于對照（P<0.05），且在試驗范圍內(nèi)黃芪甲苷濃度越高吞噬率與吞噬指數(shù)越高。

3 小結(jié)與討論

本研究從黃芪中提取黃芪甲苷，考察其對THP-1細胞活力和THP-1吞噬結(jié)核桿菌菌株H37Rv的影響，結(jié)果顯示在試驗濃度范圍內(nèi)，黃芪甲苷能顯著提高THP-1細胞活力和其吞噬H37Rv的能力，且黃芪甲苷濃度越高其作用效果越強，可見黃芪甲苷有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，這可能是因為黃芪甲苷能夠提升巨噬細胞內(nèi)次級溶酶體的體積與酶含量。試驗發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷的濃度對其作用效果的影響較大，黃芪甲苷濃度過低則作用效果較弱；濃度過高則有可能引起毒副作用，因此需要進一步研究以確定合理的用藥濃度。

參考文獻：

[1] 程紅群. 結(jié)核病的流行趨勢與防控策略[J].中華護理雜志，2007，42（7）：670-672.

[2] 劉 啟，熊南山，程 斌.黃芪免疫藥理學研究進展[J].中國中醫(yī)藥雜志，2005，2（6）：321-322.

[3] 聶紫雯， 魏強華. 黃芪免疫調(diào)節(jié)機制及臨床應用進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（8）：103-105.

[4] 張 峰，高 鵬，彭俊華. 黃芪多糖及黃芪甲苷對巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌作用的研究[J].西北國防醫(yī)學雜志，2006，26（6）：434-436.

[5] 高 鵬，張潤玲，劉燕玲，等.熒光定量PCR方法探討黃芪注射液對巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報，2005， 26（10）：894-896.