羅田板栗儲(chǔ)存后期致腐真菌的分離鑒定及致病性研究

摘要：為了研究羅田板栗（Castanea mollissima Bl.）儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生霉變的機(jī)理，從常溫儲(chǔ)存70 d后發(fā)生霉變的羅田板栗中分離其中的致腐真菌，經(jīng)鑒定屬于6個(gè)屬，分別為束絲菌屬（Ozonium sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、根霉屬（Rhiopus sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）、葡萄穗霉屬（Stachybotrys sp.）。對(duì)分離率大于10%的致腐真菌進(jìn)行回接試驗(yàn)。結(jié)果表明，在無(wú)傷接種的條件下，除了青霉屬導(dǎo)致較低的霉變率和較輕的病癥外，其余真菌均無(wú)致病力；在有傷接種的條件下，各菌株導(dǎo)致的霉變率都在60%以上且大部分表現(xiàn)出較重的病癥，其中束絲菌屬和曲霉屬導(dǎo)致的霉變率在80%以上。試驗(yàn)結(jié)果證明，板栗在有傷情況下更易腐爛，束絲菌屬和曲霉屬是板栗貯藏期腐爛的重要致病菌。

關(guān)鍵詞：板栗（Castanea mollissima Bl.）；致腐真菌；分離鑒定；致病力；羅田縣

中圖分類(lèi)號(hào)：S664.2；S436.64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2305-04

板栗（Castanea mollissima Bl.）原產(chǎn)中國(guó)，為山毛櫸科堅(jiān)果類(lèi)植物；其栽培歷史悠久，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1]。湖北省羅田縣則是板栗的原生地之一，復(fù)雜多變的地理環(huán)境為羅田板栗品種的多樣化提供了良好的生態(tài)環(huán)境條件[2]。羅田板栗是湖北省的特色農(nóng)產(chǎn)品，具有外形美觀、果大質(zhì)優(yōu)、果形端正均勻、色澤鮮艷有光澤、蠟質(zhì)層淺薄、易剝、不黏內(nèi)皮的特點(diǎn)；羅田板栗具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其可溶性糖含量與各類(lèi)氨基酸的總量高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，品質(zhì)優(yōu)于其他產(chǎn)地[2]。

由于傳統(tǒng)栽培因素，羅田板栗在采收過(guò)程中存在一些問(wèn)題，如采收期不合理、脫殼技術(shù)仍沿用傳統(tǒng)的栗苞堆漚的方式，極易造成栗苞升溫發(fā)酵，導(dǎo)致栗仁受傷[3]，加之板栗“怕干、怕濕、怕熱和怕凍”的“四怕”特性[4，5]，導(dǎo)致板栗在貯存過(guò)程中腐爛變質(zhì)嚴(yán)重，一般腐爛率達(dá)20%～30%[5]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。致病真菌是導(dǎo)致腐爛的主要原因，目前研究者對(duì)引起板栗儲(chǔ)存過(guò)程中腐爛的部分致腐菌做了分離鑒定。各地的板栗因地區(qū)差異、貯藏方式不同，從中分離的致腐菌亦有很大差別[6-12]。至今尚未見(jiàn)針對(duì)羅田板栗儲(chǔ)存過(guò)程中的致腐微生物的研究報(bào)道，故試驗(yàn)對(duì)常溫儲(chǔ)存下的羅田板栗中致腐真菌進(jìn)行分離、鑒定及致病力研究，找出使羅田板栗腐爛的主要菌群，以期降低羅田板栗在采收、貯存過(guò)程中的腐爛損失，為科學(xué)采收、綠色儲(chǔ)存作出指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

板栗樣品為市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的羅田板栗，所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｅ囵B(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL），培養(yǎng)基滅菌后每毫升加入30 U青霉素。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 板栗常溫儲(chǔ)存70 d，選取外觀帶霉斑或漂浮于水面的板栗100個(gè)。去殼后用清水沖洗3次，選取病健交界處病組織（每個(gè)栗仁5塊）切成邊長(zhǎng)2～4 mm的方形組織塊， 75%乙醇浸泡3～4 s后轉(zhuǎn)入50 mg/mL的次氯酸鈉溶液消毒2～3 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.2.2 致腐真菌的分離 栗仁表面及內(nèi)部真菌的分離采用組織分離法[13]。組織塊點(diǎn)種到PDA培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)4～5 d，待平板出現(xiàn)混合菌落后對(duì)分離的各特征菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，挑取單菌落繼續(xù)分離純化至單菌落。將純化的單菌落編號(hào)、接種到試管斜面恒溫培養(yǎng)。

1.2.3 致腐真菌鑒定 依據(jù)參考文獻(xiàn)[13-15]對(duì)純化的單菌落菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1.2.4 致病力試驗(yàn) 根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定。分離菌接種于帶殼的無(wú)病板栗上。接種前板栗用自來(lái)水沖洗后在75%乙醇和50 mg/mL次氯酸鈉溶液中各浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗2～3次。接種采用2種方法，用解剖針刺傷外殼接種（有傷接種）和用接種環(huán)接種（無(wú)傷接種），3組平行，每組接種板栗60個(gè)。接種后置滅菌牛皮紙信封中于滅菌玻璃瓶中常溫保存14 d后觀察、統(tǒng)計(jì)各真菌導(dǎo)致的霉變率及霉變程度。再做分離并培養(yǎng)以確認(rèn)病原菌。

1.2.5 霉變率及霉變程度評(píng)估 板栗果仁表面或內(nèi)部出現(xiàn)霉?fàn)€即記為壞栗果。統(tǒng)計(jì)每一平行組的霉變率，霉變率=壞栗果數(shù)/樣品栗果總數(shù)×100%，取其算術(shù)平均值為霉變率。霉變程度采取如下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]：0級(jí)：未發(fā)病；1級(jí)：接種點(diǎn)處發(fā)病，病斑基本無(wú)擴(kuò)散；2級(jí)：病斑占栗仁表面積的1/3以下；3級(jí)：病斑占栗仁表面積的1/3～3/4；4級(jí)：病斑占栗仁表面積的3/4以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉?fàn)€板栗癥狀

霉?fàn)€板栗癥狀可分為兩種情況，一是從板栗外部開(kāi)始霉?fàn)€，二是從栗仁開(kāi)始霉?fàn)€。從外部開(kāi)始霉?fàn)€的真菌可能是在生長(zhǎng)期侵入，也可能是在儲(chǔ)存期侵入，從栗仁開(kāi)始霉?fàn)€的病菌應(yīng)為生長(zhǎng)過(guò)程中侵入。

2.2 板栗儲(chǔ)存期致腐真菌的分離鑒定情況

通過(guò)分離鑒定和確認(rèn)，在板栗果仁上共有6屬致腐真菌，分別為束絲菌屬（Ozonium sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、根霉屬（Rhiopus sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）、葡萄穗霉屬（Stachyotrys sp.）。其鑒定特征如下。

束絲菌屬：該菌在板栗果仁上產(chǎn)生灰褐色棉絮狀氣生菌絲，在鏡檢過(guò)程中只發(fā)現(xiàn)不孕性菌絲，有性孢子和無(wú)性孢子均未發(fā)現(xiàn)，其不孕性菌絲在培養(yǎng)基中呈棉絮狀，菌體由粗大的菌絲交織而成，主要菌絲連接成束。其菌落背面通常呈藍(lán)紫色（圖1）。

鐮刀菌屬：在板栗果仁上產(chǎn)生白色棉絮狀氣生菌絲，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色或淺粉紅色，氣生菌絲發(fā)達(dá)； 分生孢子梗單生或聚集成分生孢子座，細(xì)長(zhǎng)或粗短，分生孢子有大小兩種，在PDA培養(yǎng)基上多見(jiàn)大型分生孢子，多細(xì)胞，微彎或兩端尖而彎曲顯著，形近鐮刀形、紡錘形，大小為5.04 μm×（20.1～30.4） μm；小型孢子多數(shù)單細(xì)胞，圓形，單生或成串，直徑2.5 μm（圖2）。

曲霉屬：分離出來(lái)的為曲霉屬的黑曲霉，在板栗果仁的基部寄生，寄生部位顏色為灰黑色。菌絲無(wú)色、淡色，有隔膜，分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細(xì)胞垂直生出，分生孢子梗大多無(wú)隔，光滑或粗糙，梗的頂部膨大成球形或燒瓶形的頂囊，從頂囊的表面以放射狀生出小梗，小梗單層或在頂部再分支成兩個(gè)至多個(gè)的小梗。分生孢子串生于小梗頂端，輻射狀排列，分生孢子圓形，直徑3～5 μm（圖3）。

青霉屬：一般在板栗果仁的基部出現(xiàn)，通常呈綠色，也有呈灰綠、黃綠、青綠色。分離的菌株中青霉屬的種較多，在PDA培養(yǎng)基上菌落中央呈綠色、灰綠色或藍(lán)綠色，邊緣白色或黃色，有的種有放射狀溝紋，菌落表面大多呈粉狀，也有的呈松絮狀，其背面顏色有白色、黃色、褐紅色3種。其分生孢子梗從菌絲垂直生出，無(wú)足細(xì)胞，分散或聚集成孢梗束，具隔膜，頂端分支排列成掃帚狀，分支1次或多次，對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)，最后一級(jí)產(chǎn)生分生孢子；分生孢子串成不分支的鏈狀，單個(gè)孢子圓形或卵圓形，長(zhǎng)徑2.5～3.5 μm（圖4）。

根霉屬：分離出來(lái)的為根霉屬中的黑根霉，在板栗果仁上先長(zhǎng)出白色的氣生菌絲，后長(zhǎng)出黑色的孢子嚢，使栗果呈黑色。在培養(yǎng)基中菌絲向四周蔓延，常鋪滿整個(gè)平板，其營(yíng)養(yǎng)菌絲產(chǎn)生弧形的匍匐菌絲，在假根的上方生出孢囊梗，頂端形成孢子囊，菌絲無(wú)隔，孢子多且無(wú)色，孢囊孢子圓形，直徑3.5～5.5 μm（圖5）。

葡萄穗霉屬：該菌使栗仁包裹灰白色菌絲。在培養(yǎng)基上菌落初期灰白色，后期老化，暗褐色。分生孢子梗從菌絲直立生出，分枝透明或淺褐色，在分枝末端生瓶梗，單生、對(duì)生至輪生。分生孢子橢圓形，長(zhǎng)徑為10～15 μm（圖6）。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株的確定

統(tǒng)計(jì)分離菌株類(lèi)型及數(shù)量得到各菌株的分離率（表1），其中分離率大于10%的菌株有曲霉屬、鐮刀菌屬、束絲菌屬、青霉屬、根霉屬。試驗(yàn)中曲霉屬的黑曲霉的分離率最高。

2.4 致腐真菌的致病力

用分離率大于10%的致腐菌對(duì)健康板栗果進(jìn)行回接，結(jié)果顯示接種的真菌均為致腐菌，對(duì)病果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到各致腐菌的致病力情況（表2）。在有傷接種情況下各優(yōu)勢(shì)菌的霉變率較高，都在60%以上，而5種真菌混合接種霉變率達(dá)到了100.0%；霉變程度除鐮刀菌屬為2級(jí)外，其他為3～4級(jí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵染擴(kuò)散性。在無(wú)傷接種情況下，混合接種霉變率為13.6%，單獨(dú)接種時(shí)除青霉屬出現(xiàn)少量霉變外，其他病原菌接種皆未出現(xiàn)病癥；除青霉屬出現(xiàn)2級(jí)霉變外，其余菌株均無(wú)病斑出現(xiàn)。說(shuō)明板栗在儲(chǔ)存過(guò)程中保持栗果的完整性對(duì)降低栗果霉變有重要意義。在有傷接種中，束絲菌屬的霉變率高達(dá)90.8%，可見(jiàn)束絲菌屬對(duì)有損傷的羅田板栗具有很強(qiáng)的侵染能力，而對(duì)于好果，只有青霉屬能突破栗殼而侵染栗仁。

3 小結(jié)與討論

致腐真菌的侵染是板栗儲(chǔ)存過(guò)程中腐敗的主要原因，研究中分離出6屬致腐菌，其中5屬為霉變果仁真菌優(yōu)勢(shì)菌，分別為束絲菌屬、曲霉屬，鐮刀菌屬，根霉屬，青霉屬。經(jīng)回接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在有傷的情況下優(yōu)勢(shì)菌都具有較高的致病力，且病情大部分較嚴(yán)重；而無(wú)傷條件下只有青霉屬能突破栗殼侵染栗仁，且病情較輕，其他菌株基本無(wú)致病力，說(shuō)明板栗果在有傷條件下更易腐敗。故在板栗采收過(guò)程中應(yīng)采用科學(xué)的采收方法，保證栗殼的完整性，減少采收和儲(chǔ)存過(guò)程中的栗殼破損。

板栗的霉變是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，栗仁從產(chǎn)生霉斑到腐爛變質(zhì)先慢后快[5-7]，品種、貯藏方式、貯藏時(shí)間等都可引起板栗霉變過(guò)程中的真菌種類(lèi)和數(shù)量發(fā)生改變[8]；這也是本研究分離的菌株與前人報(bào)道存在較大差異的原因。雖然已報(bào)道分離的菌株數(shù)量和具體種類(lèi)不同，但所有研究均報(bào)道分離出了鐮刀菌屬及曲霉屬。北京地區(qū)板栗以鏈格孢屬、鐮刀菌屬、聚端孢屬和殼梭孢屬為主要致病菌[6]，遷西板栗以毛霉屬、青霉屬、殼梭孢屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、疫霉屬和短梗霉屬分離率較高[7]，冷藏的蘇北板栗則以擬莖點(diǎn)霉、殼梭孢、炭疽菌、毛霉及栗疫菌等為優(yōu)勢(shì)菌[8]。這亦說(shuō)明不同地區(qū)、不同的貯藏方式下板栗霉變機(jī)理不盡相同，其保鮮技術(shù)的開(kāi)發(fā)亦應(yīng)有區(qū)別。

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