鹽堿湖桿菌菌株MIM18的培養特性

摘要：對分離自內蒙古自治區渾善達克鹽堿湖的一株桿菌菌株MIM18的培養特征進行了研究。結果表明，該菌為革蘭氏陽性桿菌，粉紅色，分泌過氧化氫酶、精氨酸雙水解酶和賴氨酸脫羧酶，對常見的抗生素高度敏感。生長鹽濃度為0～55 g/L，最適鹽濃度為10 g/L；溫度范圍24～40 ℃，最適溫度33 ℃；pH 6.0～11.0，最適pH 9.5。好氧，屬于兼性嗜堿菌。

關鍵詞：鹽堿湖；兼性嗜堿菌；培養特征

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2295-04

嗜堿菌是一類最適生長于pH大于或等于9的環境中的微生物，根據它們在pH 7 條件下生長與否可分為專性嗜堿菌和兼性嗜堿菌兩大類[1，2]。對于嗜堿菌新菌株的分離、堿性蛋白酶的基因克隆和應用、極端環境適應機制、結構新穎的活性產物的分離都是當今極端環境微生物研究的熱點[3-6]。嗜堿菌已廣泛應用于發酵工業、石油化工、農作物生長改良和環境污染物的生物修復等多個領域[7，8]。目前，對嗜堿菌的嗜堿機理研究又有了新的重要突破[9]。

內蒙古有廣闊的鹽堿湖分布，蘊藏著豐富的微生物資源，其中嗜堿微生物呈現較高的生物多樣性[10，11]。嗜堿菌有很高的經濟價值和生產應用潛力，對其進行深入研究和開發利用，將成為我國戰略生物資源的平臺之一，有利于發揮生物技術創新的支撐作用。因此，對分離于渾善達克鹽堿湖的一株嗜堿菌的基本特征進行了分析，以期為進一步認識和開發內蒙古地區的極端環境微生物資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽堿湖桿菌菌株 鹽堿湖桿菌菌株MIM18由內蒙古農業大學生命科學學院應用與環境微生物研究所從內蒙古渾善達克鹽堿湖中分離獲得。

1.1.2 培養基

1）液體培養基。酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。

2）固體培養基。在液體培養基中加入瓊脂15 g/L制成。

3）半固體培養基。在液體培養基中加入瓊脂4 g/L制成。

4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。

5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫辛酸 0.05。

1.2 方法

1.2.1 形態特征和生長曲線的繪制 通過革蘭氏染色和平皿劃線培養的方法來觀察MIM18的基本形態特征。將MIM18菌種接種于含100 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴搖床光照培養。隔時取樣于600 nm處測定吸光度。以培養時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.2 耐鹽試驗 調整培養基中鹽濃度分別為0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固體培養基平皿劃線光照培養測定MIM18的耐鹽程度；液體培養基（裝液量為100 mL/（250 mL），接種量2%）33 ℃、200 r/min水浴搖床培養3 d后于600 nm處測定吸光度，每個梯度3個平行[12，13]。

1.2.3 pH對生長的影響 調整培養基的pH分別為5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培養測定方法同1.2.2。

1.2.4 溫度對生長的影響 采用含NaCl的培養基，分別置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的條件下培養，培養測定方法同1.2.2。

1.2.5 氧氣對生長的影響 半固體培養基穿刺培養，每12 h觀察一次。觀察菌體的生長情況及位置。液體靜置和搖床培養，觀察菌體在液體中的分布。

1.2.6 光照對產色素的影響 劃線接種固體培養皿3個，兩個平皿用錫箔紙包住避光培養，24 h后將錫箔紙中的一個平皿光照培養，另一個仍避光培養，第三個平皿一直光照培養。

1.2.7 產酶種類和抗生素敏感性分析 產酶種類測定參考《常見細菌系統鑒定手冊》[14]和文獻[15]中的方法進行。抗生素敏感性試驗采用藥敏紙片檢測法[16]進行。

2 結果與分析

2.1 MIM18的生長曲線

通過7 d的恒溫搖床培養和吸光度測定，繪制出MIM18的生長曲線（圖1）。從圖1可以清晰看到0～12 h為延滯期，12～72 h為指數生長期，72～120 h為穩定期，120 h后進入衰亡期。

2.2 鹽濃度對MIM18生長的影響

經過培養，MIM18可在鹽濃度0～55 g/L范圍內生長。對比各鹽濃度的生長狀況發現，在鹽濃度0～40 g/L時均能較好地生長。鹽濃度為0 g/L時，菌落的顏色明顯淡于鹽濃度10～40 g/L時的菌落顏色（圖2、圖3）。鹽濃度為50 g/L時，有少數菌落生長，鹽濃度為55 g/L時只有5個左右的小菌落，鹽濃度≥60 g/L時幾乎不生長。說明低鹽有利于MIM18的生長，過高的鹽濃度將會抑制其生長。通過不同鹽濃度培養后測定吸光度比較發現（圖4），MIM18在鹽濃度0～10 g/L范圍內隨著鹽濃度升高有利于MIM18的生長，在鹽濃度為10 g/L時生長情況最好；在鹽濃度10～40 g/L時抑制MIM18的生長，但抑制效果不明顯，當鹽濃度為40 g/L以上時MIM18的生長明顯受到抑制。

2.3 pH對MIM18生長的影響

經平板培養可知，MIM18適應pH變化能力較強，能在pH 6.0～11.0環境下生長。當pH≤5.5或≥11.5時該菌株不生長。當pH 6.0、7.0和11.0時該菌株生長比較緩慢；pH 8.5～10.0時MIM18生長隨pH的增大逐漸加快，pH 9.5時最適生長，生長最快，也最先達到穩定期，之后生長量隨pH增大而減小（圖5）。

2.4 溫度對MIM18生長的影響

經平板培養可知，MIM18的生長溫度范圍為24～40 ℃，大于40 ℃時不再生長。從圖6可以看出，33～36 ℃為MIM18生長的適宜溫度范圍。

2.5 氧氣對MIM18生長的影響

半固體培養基穿刺光照培養24 h后，穿刺孔上部有生長跡象，之后半固體斜面生長跡象加強，穿刺孔中生長跡象逐漸減弱直至消失；液體培養時，只在液面處生長，說明氧氣是MIM18生長的必要條件，MIM18不具有運動性。搖床振蕩培養與靜置培養對比結果表明搖床培養條件下MIM18的生長狀況明顯優于靜置培養，說明搖床培養提供的氧氣對MIM18生長有重要作用。

2.6 光照對MIM18產色素的影響

如圖7所示，3種光照處理方式下MIM18生長狀況、菌落形態基本一致，說明光照對MIM18的色素合成乃至生長無影響。

2.7 MIM18的產酶種類和抗生素敏感性

經測定，該菌株在生長中產生接觸酶（過氧化氫酶）、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶，不產生脲酶、苯丙氨酸脫氨酶、酯酶；甲基紅和硫化氫試驗為陽性；它對常見的抗生素（青霉素-G、紅霉素、氯霉素、四環素、慶大霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、羅紅霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、桿菌肽）均表現為高度敏感。

3 結論與討論

MIM18在鹽濃度0～40 g/L范圍內都能較好生長，適應能力較強，甚至在無鹽條件下也能生長，在鹽濃度10 g/L時就能達到最適鹽濃度，說明其生長對鹽量要求不大，當鹽濃度超過40 g/L時生長明顯受到了抑制，因此MIM18不是嗜鹽菌[10]；MIM18不僅能在強堿條件下生長而且能在pH 7下生長，因此是兼性嗜堿菌[11]。另外，MIM18在溫度方面要求也不十分嚴格，30～36 ℃生長差異不是很大。MIM18對pH和周圍環境的氧氣量變化很敏感，氧氣是其生長的必要條件，光照對其色素合成乃至生長沒有影響。

嗜堿菌是鹽堿湖中數量大、分布廣的極端微生物。由于其獨特的環境適應模式，特殊的生理機制，獨特的基因類型，并有多種代謝產物可以利用，因而不僅成為了生命科學理論研究的理想材料，而且成為一類具有很大開發潛力的生物資源[17]。近年來，嗜堿微生物的研究發展迅速，已應用于諸如清潔劑生產[18]、生物表面活性劑[19]、農作物生長促進劑[20]和天然產物的生物轉化、環境污染物降解[8，21，22]等多個方面。對鹽堿湖菌的深入研究，不僅可以開發新的微生物基因資源，而且將大大促進微生物在人類健康、環境保護和生物技術等領域的利用。

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