藍莓菌根真菌液體培養條件的正交試驗優化

摘要：采用正交試驗設計研究不同溫度、pH、不同碳源和氮源等因子對一株藍莓菌根真菌生長的影響。結果表明，4種因子對菌根真菌生長的影響程度依次為pH、氮源、溫度和碳源，其中，pH對菌根真菌的生長有顯著影響。菌根真菌最適宜液體培養條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養基。

關鍵詞：藍莓（Vaccinium uliginosum L.）；菌根菌；培養條件；溫度；pH；碳源；氮源

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2268-02

藍莓（Vaccinium uliginosum L.）屬杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，其果實除含有一般水果中的有機酸、維生素和礦物質外，還含有豐富的花青素、不飽和脂肪酸、鞣花酸及微量元素鉀、鈣、鋅、鐵等，VE和B族維生素的含量也比較高[1]。據美國農業部人類營養研究中心的研究報道，藍莓的抗氧化作用列各種水果、蔬菜之首。它是抗癌、預防血栓及動脈硬化、抗泌尿系統感染、預防心臟疾病和延緩衰老的非常可靠的保健食品，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一[2]。

藍莓為淺根系植物，根系不發達，無根毛，根纖細，呈纖維狀，主要分布在淺土層。藍莓根系一般水平分布范圍在樹冠的投影區域內，深度為30～45 cm，因此藍莓對土壤條件要求嚴格，其中土壤pH、土壤水分、透氣性、排水性等條件對藍莓生長有很大影響，不適宜的土壤條件常導致藍莓栽培失敗，藍莓通常在有機質含量高、土壤通氣性良好和水分充足而穩定的酸性沙質土壤中生長良好[3，4]。但在自然狀態下，藍莓根系與菌根真菌共生形成菌根。目前已發現浸染藍莓的菌根真菌有10余種。值得注意的是，幾乎所有藍莓的細根都有內生菌根真菌的寄生，從而解決了藍莓根系由于沒有根毛造成的對水分及養分吸收能力下降的問題。菌根真菌的侵染對藍莓的生長發育及養分吸收起著重要作用[5-8]。

菌根真菌菌株MF002[晶粒鬼傘（Coprinus micaceus）MF002]屬于傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬，由遼寧省農業科學院微生物中心從野生藍莓中分離篩選。接種菌根真菌菌株MF002可以顯著促進藍莓生長、增加藍莓鮮果的花青素、鞣花酸含量。但目前關于藍莓菌根真菌的純培養研究尚少。因此，采用正交試驗設計研究不同因子對分離自藍莓根部的菌根真菌菌株MF002液體培養的影響，旨在探索適宜于其生長的最佳條件，以期為菌絲體的擴繁和菌劑生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試菌株MF002[晶粒鬼傘（Coprinus micaceus）MF002]，由遼寧省農業科學院微生物中心提供，分離自野生藍莓根內。

1.1.2 固體基礎培養基 改良MMN培養基。CaCl2·2H2O 0.05 g，麥芽粉3 g，NaCl 0.025 g，葡萄糖10g，KH2PO4 0.5 g，牛肉膏蛋白胨15 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，維生素B1 0.1mg，MgSO4·7H2O 0.15 g， FeCl3（1%溶液）1.2 mL，瓊脂20g，去離子水1 000 mL。

1.2.3 液體基礎培養基 按照正交試驗設計，將改良MMN培養基中的碳源（葡萄糖+麥芽汁）分別用20 g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉替代，用0.25 g/L的無機氮源[（NH4）2HPO4、NH4NO3、KNO3]和3 g/L的有機氮源（蛋白胨）替代培養基中的氮源[（NH4）2HPO4+麥芽汁]，制成液體基礎培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將菌株MF002接種于改良的MMN固體培養基上，28 ℃下培養4 d，備用。

1.2.2 搖床培養 將配制好的液體培養基分裝到100 mL三角瓶中，每瓶50 mL，在121 ℃、0.05 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后每瓶定量接種1塊直徑為7 mm的活化菌餅，每處理3次重復。150 r/min條件下培養7 d。

1.2.3 菌絲體干重的測量 將三角瓶中發酵液及菌絲體過濾，于80 ℃烘箱中烘干，記錄菌絲體干重。

1.2.4 試驗設計 采用L9（34）正交試驗設計，試驗因素與水平見表1。

1.2.5 統計方法 培養7d后進行生物量測定。試驗數據用SPSS統計分析軟件和Microsoft excel 進行統計分析。

2 結果與分析

試驗結果（表2）表明，9個處理的菌絲體干重平均值存在差異，在處理6的培養條件下，MF002的菌絲體干重顯著高于其他處理，為0.117 4 g/（50 mL）。由此得出菌株MF002的最佳液體培養條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養基。

3 小結

通過L9（34）正交試驗初步確定了MF002菌株最佳液體培養條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養基，此條件下MF002菌絲體干重平均為0.117 4 g/（50 mL）。研究可為今后藍莓菌根真菌的規模化生產提供參考。

參考文獻：

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