鴿源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及毒力因子分析

摘要：通過從活禽市場上取鴿子泄殖腔拭子，分離鑒定了4株空腸彎曲桿菌（Campylobater jejuni）菌株，PCR調(diào)查發(fā)現(xiàn)，4株菌株均具有細(xì)胞膨脹毒素等9個(gè)重要的毒力相關(guān)因子。選取其中2株進(jìn)行毒力基因序列分析，序列比對(duì)結(jié)果顯示該鴿子源空腸彎曲桿菌的毒力基因序列與已測序的同時(shí)從人和禽屠宰場中分離到的空腸彎曲桿菌M1株的毒力基因相似度最高。

關(guān)鍵詞：鴿子；空腸彎曲桿菌（Campylobater jejuni）；毒力因子

中圖分類號(hào)：S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：0439-8114（2013）24-6120-04

彎曲桿菌病（Campylobater jejuni）是在世界范圍廣泛流行的人獸共患病，該病引起成人和兒童腹瀉，已經(jīng)成為危害食品安全的重要食源性疾病，其病原主要為空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）等彎曲桿菌屬的細(xì)菌[1]。空腸彎曲桿菌宿主范圍廣，是野生、家養(yǎng)動(dòng)物的正常寄居菌，在腸道內(nèi)有大量細(xì)菌，感染的動(dòng)物通常無明顯病癥，但可長期向外界排菌，通過排泄物或分娩污染食物和飲水，從而引起人類感染[2]。

鴿子也是空腸彎曲桿菌的自然宿主之一，隨著鴿子越來越多的被人工飼養(yǎng)，并擺上餐桌或者成為寵物，鴿子也成為人感染彎曲桿菌病病原潛在的中間宿主。本研究從活禽市場上取鴿子泄殖腔拭子分離鑒定到4株空腸彎曲桿菌菌株，并進(jìn)行了毒力基因和毒力相關(guān)基因的分析，認(rèn)為本次活禽市場上分離的空腸彎曲桿菌具有感染人類的潛在威脅。

1 材料與方法

1.1 菌株

C. jejuni ATCC 33291菌株購自中國菌種保藏中心，該菌分離自人的糞便。臨床分離菌株由動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試劑與儀器

用于空腸彎曲桿菌分離培養(yǎng)和增菌的改良CCD瓊脂（mCCDA）培養(yǎng)基和布氏肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。厭氧培養(yǎng)罐和微需氧產(chǎn)氣袋購自O(shè)XOID公司，rTaq酶、dNTPs、DNA maker購自寶生物（大連）工程有限公司。DNA瓊脂糖膠回收試劑盒購自Axygen公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離 在活禽市場隨機(jī)取鴿子泄殖腔拭子標(biāo)本50份，直接劃線接種于mCCDA平板，在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落特征，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，利用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，并進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。

1.3.2 DNA模板的制備 在mCCDA平板上挑取培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌單菌落，經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取空腸彎曲桿菌的基因組，詳細(xì)步驟見試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定結(jié)果

取鴿子泄殖腔拭子劃線分離，經(jīng)過純化后觀察到4株空腸彎曲桿菌疑似菌株，分別命名為G2-14、G2-19、G2-20、G2-31，該菌在mCCDA平板上觀察到扁平、灰色、濕潤、有光澤、呈沿線擴(kuò)散生長且邊緣不規(guī)則的菌落，經(jīng)革蘭氏染色后該菌呈紅色，為革蘭氏陰性菌株，菌株較其他常見腸道菌如大腸桿菌、沙門氏菌的小，形態(tài)細(xì)長，呈彎曲狀或海鷗狀，與購買的空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)一致。

2.2 菌株的16 S rRNA測序鑒定結(jié)果

分離菌株使用細(xì)菌擴(kuò)增16 S rRNA的通用引物成功擴(kuò)增出長度約為1 500 bp的DNA片段，測序后結(jié)果與空腸彎曲桿菌的16 S rRNA序列100%同源，證明分離的菌株G2-14與G2-31為空腸彎曲桿菌。

2.3 毒力相關(guān)基因的鑒定

選取G2-19、G2-31和空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C. jejuni ATCC 33291，使用9對(duì)引物分別擴(kuò)增了毒力因子或毒力相關(guān)因子（cdtA、cdtB、cdtC、ciaB、cheY、cadF、peb1、fliA和flaA）的部分片段，如圖1所示，片段大小均與預(yù)期相符，2株分離的空腸彎曲桿菌和購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株均編碼有這些毒力基因或毒力相關(guān)基因。

2.4 毒力基因的序列分析

為了進(jìn)一步分析菌株之間的差異，將以上擴(kuò)增的毒力基因或毒力相關(guān)基因片段進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與已經(jīng)全基因組測序的空腸彎曲桿菌菌株相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)菌株包括人源菌株C. jejuni NCTC 11168、C. jejuni 81-176、C. jejuni 81116、C. jejuni M1、C. jejuni ICDCCJ07001，雞源菌株C. jejuni RM1221、C. jejuni S3，羊源菌株C. jejuni IA3902和C. jejuni PT14。其中C. jejuni M1同時(shí)在病人和家禽屠宰場分離到，為家禽到人類的傳播提供了直接證據(jù)[4]。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株flaA基因序列差異較大，其余各個(gè)毒力相關(guān)基因序列相似性都達(dá)到90%以上，其中部分基因非常保守，如cheY，但是其他基因還是存在一定堿基的差異。其中分離菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1相似度最高，如表3所示，除flaA以外，相似度均達(dá)到99%以上，對(duì)序列進(jìn)行聚類分析顯示，分離菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1均聚為一類，尤其是cdtB、cdtC和fliA基因，G2-14、G2-31、C. jejuni M1達(dá)到100%一致（圖2），而與其他大部分測序的菌株均呈現(xiàn)出多個(gè)位點(diǎn)的堿基差異。

3 小結(jié)與討論

彎曲桿菌病已經(jīng)成為造成人類腹瀉的重要病因之一，其中空腸彎曲桿菌是最為重要的病原，該菌宿主范圍較廣，覆蓋雞、鴨等禽類動(dòng)物以及豬、牛等哺乳動(dòng)物，肉制品污染彎曲桿菌已經(jīng)成為人類感染彎曲桿菌病的重要原因[5]。以往的研究中采集雞、鴨等樣品，分離到大量的彎曲桿菌[6]，本研究從活禽市場鴿子泄殖腔拭子樣本中分離到空腸彎曲桿菌，說明活禽市場中鴿子也是重要的空腸彎曲桿菌攜帶源，提示在飼養(yǎng)或者食用鴿子的過程中，也要做好彎曲桿菌的防范工作。

空腸彎曲桿菌致病主要包括了4個(gè)步驟：黏附上皮細(xì)胞、定植消化道、侵入靶細(xì)胞和產(chǎn)生與釋放毒素[3，7]。在這個(gè)過程中，一系列毒力因子和毒力相關(guān)因子發(fā)揮了重要作用。fliA基因編碼了鞭毛合成蛋白，調(diào)控了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、蛋白分泌和細(xì)胞黏附與侵入是影響細(xì)菌毒力的重要因子[8]；cdtABC編碼了空腸彎曲桿菌惟一的毒素——細(xì)胞致死膨脹毒素，被認(rèn)為是主要的致病相關(guān)因子[9]。ciaB編碼彎曲桿菌侵入抗原[10]，cadF編碼牽連蛋白[11]，peb1編碼周質(zhì)結(jié)合蛋白，它們均與細(xì)菌的黏附和侵入相關(guān)[12]，cheY編碼調(diào)控鞭毛運(yùn)動(dòng)的調(diào)控子[13]， flaA也同樣是重要的毒力相關(guān)因子，缺失這些基因后均導(dǎo)致細(xì)菌毒力顯著降低[14]。毒力因子調(diào)查顯示分離的鴿子源空腸彎曲桿菌G2-19、G2-31同樣具有這些重要的毒力因子或毒力相關(guān)因子。基因序列分析發(fā)現(xiàn)，G2-19、G2-31的fliA和cdt毒素基因序列和C. jejuni M1高度相似。

Friis等[4]同時(shí)在人和家禽屠宰場中分離到C. jejuni M1菌株，為空腸彎曲桿菌的禽傳人提供了直接的證據(jù)，全基因組測序后，與其他測序的空腸彎曲桿菌比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌具有很多特異的雞內(nèi)定植相關(guān)的基因。本研究發(fā)現(xiàn)，鴿子中分離的空腸彎曲桿菌G2-19、G2-31與C. jejuni M1菌株毒力基因序列最為相似，暗示著該菌株也具有禽和人之間傳播和交叉感染的能力，對(duì)人類的身體健康具有潛在的威脅。在后續(xù)的試驗(yàn)中將進(jìn)一步通過動(dòng)物試驗(yàn)研究分離的菌株對(duì)家禽和哺乳動(dòng)物的致病性。

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