五色梅葉內生真菌YJ—11的分離鑒定及其抑菌活性

摘要：從廣東藥用植物五色梅（Lantana camara L.）葉片中分離到一株內生真菌YJ-11，通過顯微形態特征觀察鑒定屬于青霉屬（Penicillium sp.）。液態靜置培養后，進行有效成分提取，獲得其菌絲體甲醇提取物和發酵培養液乙酸乙酯提取物。體外抑菌試驗結果表明，兩種提取物對供試細菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）均具顯著抑菌活性。

關鍵詞：五色梅（Lantana camara L.）葉片；內生真菌；青霉屬（Penicillium sp.）；抑菌活性

中圖分類號：Q939.96；R93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6048-03

自從1929年弗萊明發現青霉素以來，微生物活性代謝產物成為藥物的豐富源泉，現代幾乎所有臨床應用的抗生素都來源于微生物。近年隨著新病原菌和新病毒的不斷出現，癌癥和心血管病的不斷增加，特別是隨著藥物的濫用，導致病原微生物產生了抗藥性，人們迫切需要尋找到新的療效顯著而毒副作用小的天然藥物。植物內生菌[1]生活在植物組織內部，與宿主協同進化，二者形成了互惠關系，一方面植物為內生菌提供光合作用產物和礦物質，另一方面內生菌的代謝物能刺激宿主植物的生長發育，增強宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。內生菌不僅能夠參與植物次生代謝物的合成或對植物次生代謝物進行轉化，而且還能夠獨立產生豐富的次生代謝產物。Stierle等[2]報道從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中分離到的內生真菌Taxomyces andreanae能產生抗癌活性物質紫杉醇。Strobel等[3]發現植物內生真菌Gliocladium roseum（NRRL 50072）可以產生生物柴油。植物內生菌已引起研究者們的極大興趣[4-7]，并寄希望于從中發現具有特殊功能、療效顯著、毒副作用小的新穎藥物先導物。

五色梅（Lantana camara L.）[8]又名馬纓丹，為馬鞭草科（Verbenaceae）馬纓丹屬（Lantana）植物，原產美洲熱帶，中國南北都有引種栽培，以廣東、福建、臺灣、浙江、云南、四川等地為多，華南地區的荒郊野外多有大量分布。其根、莖、葉、花可作中藥用，具有清熱解毒、散結止痛、祛風止癢之功效；葉煎湯洗治濕疹、疥癩毒瘡、皮炎、皮膚瘙癢、臃腫，搗爛敷患處能治跌打筋傷。研究表明，五色梅提取物具有抗菌、抗病毒、消炎、抗腫瘤等生物活性，其主要有效化學成分為三萜類和黃酮類化合物[9-11]，但鮮有關于五色梅內生菌研究的報道。本研究在對五色梅植物化學成分研究的基礎上[12-14]，對五色梅內生真菌進行了分離，通過顯微鏡形態特征觀察鑒定并篩選到一株內生真菌YJ-11，研究了其粗提物的抑菌活性，為進一步研究開發該菌奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 五色梅枝條，2011年10月采自佛山科學技術學院北院校區，采后10 min內帶回實驗室進行內生真菌的分離。

1.1.2 供試病原菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu），由佛山科學技術學院微生物學教研室提供。

1.1.3 培養基 抗生素PDA培養基用于內生真菌的分離純化，其組成為PDA培養基（國產BR級）40 g、鏈霉素200 mg和水1 000 mL，用NaOH調pH至7。GYP培養基用于內生真菌的液體培養，其組成為葡萄糖10 g， 蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，水1 000 mL，用NaOH調pH至7。LB培養基用于細菌液體培養，其組成為胰蛋白胨10 g 、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，水1 000 mL，調節pH至7.4。肉湯瓊脂培養基用于細菌固體培養，其組成為營養瓊脂（普通肉湯瓊脂培養基）4 g，水100 mL。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離純化 取五色梅葉用清水洗凈， 70%乙醇溶液沖洗30 s，無菌水沖洗2次，置于0.2%氯化汞溶液中浸泡30 min，無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干水。在無菌條件下將五色梅葉剪成小片，置于抗生素PDA培養基上，28 ℃培養箱中倒置培養 3～7 d，待真菌從組織塊邊緣長出后，挑取菌絲轉接到PDA培養基進行純化培養。反復轉接純化直到菌落形態一致，得到純培養菌株YJ-11。PDA試管斜面接種、液體石蠟封存、 4 ℃冰箱保存。

1.2.2 內生真菌的形態觀察與鑒定 從純化培養數日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成玻片，置于光學顯微鏡下觀察，對照資料[15]確定真菌的分類學地位。

1.2.3 內生真菌的液態培養 1 000 mL三角瓶每瓶裝400 mL GYP培養基，1.25×105 Pa高壓滅菌30 min，冷卻至室溫備用。從試管斜面挑取菌絲到PDA培養基上活化培養3～7 d，將活化后的菌絲接種到三角瓶中， 30 ℃搖瓶發酵培養14 d。

1.2.4 內生真菌粗提物的制備 液體培養完成后，取發酵產物用紗布過濾，得菌絲體和發酵培養液。菌絲體風干后用甲醇浸泡提取3次，每次24 h，合并甲醇提取液，50 ℃以下減壓回收甲醇，得到菌絲體甲醇提取物A；發酵培養液用乙酸乙酯等體積萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，50 ℃以下減壓回收乙酸乙酯，得到培養液乙酸乙酯提取物B。

1.2.5 內生真菌提取物體外抑菌活性測定 采用紙片瓊脂擴散法[16]測定內生真菌YJ-11粗提物對金黃色葡萄球菌的抑制作用。將提取物A和提取物B分別溶于二甲基亞砜中，配成濃度為50 mg/mL的藥液備用。測定粗提物抑菌活性步驟如下：①制作金黃色葡萄球菌菌懸液。將金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養基，室溫下靜置培養24 h，得菌懸液。②測定粗提物抑菌活性。在無菌條件下將金黃色葡萄球菌菌懸液均勻涂布于肉湯瓊脂培養基平板上，將直徑6 mm無菌藥敏紙片貼于平板上，其中2片藥敏紙片上分別加入100 μL含提取物A和B的二甲基亞砜藥液。試驗設陰性對照（僅加二甲基亞砜），陽性對照（加鏈霉素），3個重復。于35 ℃孵育24 h，測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 內生真菌YJ-11的分離鑒定

通過分離培養得到一株純的內生真菌YJ-11（圖1），其菌落呈淡藍色，氣生菌絲為松絮狀，分生孢子梗光滑，具橫隔，頂端生有掃帚狀分枝，初步鑒定為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）青霉屬（Penicillium sp.）。

2.2 內生真菌YJ-11體外抑菌活性

紙片瓊脂擴散法測定結果表明，藥敏紙片含5 mg提取物A和提取物B時，其周圍產生明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑分別為（38.5±3.3） mm和（15.0±5.0） mm。根據紙片擴散法抑菌結果判斷標準[17]，確定內生真菌YJ-11菌絲體和發酵培養液提取物對受試細菌金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性。該菌值得進一步研究開發。

3 結論

從廣東藥用植物五色梅葉中分離得到一株內生真菌YJ-11，鑒定屬青霉屬，體外抑菌試驗結果表明，該內生真菌菌絲體甲醇提取物和發酵培養液乙酸乙酯提取物均能有效地抑制金黃色葡萄球菌。

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