兩種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶部分酶學性質研究

摘要：對串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）所產葡萄糖淀粉酶部分酶學性質進行了研究，結果表明這2種鐮刀菌產的葡萄糖淀粉酶的性質較為相似。50～60 ℃酶活性較高，最高酶活性出現在50 ℃，串珠鐮刀菌比禾谷鐮刀菌所產生的酶熱穩定性稍高。pH 5.0～6.0之間酶活性較高，pH 5.0～8.0之間穩定。金屬離子Mn2+、Cu2+對2種鐮刀菌產酶的酶活性有較強的激活作用，其中Mn2+激活作用最強烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對照的176%和173%。金屬離子Na+、Ca2+及Fe2+則會抑制這2種鐮刀菌產葡萄糖淀粉酶的活性。

關鍵詞：串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）；禾谷鐮刀菌（F. graminearum）；葡萄糖淀粉酶；酶學性質

中圖分類號：TQ925 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6026-04

葡萄糖淀粉酶（E.C 3.2.1.3）從淀粉的非還原端水解α-1，4糖苷鍵產生β-D-葡萄糖，由于葡萄糖淀粉酶對淀粉的水解以葡萄糖為惟一產物[1]，因此葡萄糖淀粉酶在以葡萄糖為原料的一些生物行業有廣泛應用，特別是在食品、醫藥、發酵等領域[2，3]。

工業上應用的葡萄糖淀粉酶主要來自于曲霉屬（Aspergillus）及根霉屬（Rhizopus）[4-10]， 鐮刀菌屬（Fusarium）的葡萄糖淀粉酶報道較少。曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學性質的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的葡萄糖淀粉酶，如半裸鐮刀菌（F. pallidoroseum）[11]、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）[11]、茄腐皮鐮刀菌（F. solani）[12]、蔗草鐮刀菌（F. scirpi）[12]等也有報道，不同來源的酶性質存在很大差異。這些絲狀真菌能夠將合成的酶蛋白分泌到胞外，便于酶的提取純化。不同來源的葡萄糖淀粉酶性質不同，在耐熱性、pH穩定性以及催化活性上都存在差別，而不同的生物加工過程需要不同性質的酶，因此對新型的葡萄糖淀粉酶進行篩選并開展性質研究顯得特別重要。

前期對幾十株真菌進行了淀粉降解酶的篩選工作，從中得到產酶活性較高的一株串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）以及一株禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），本研究對其中的部分酶學性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

串珠鐮刀菌以及禾谷鐮刀菌由山東省應用微生物重點實驗室篩選并保存。生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 固態發酵 250 mL三角瓶中裝麥麩5 g，加水5 mL，121 ℃蒸汽滅菌。用7 mm打孔器從長滿菌絲的PDA平板上打出3個菌斑接種至三角瓶，28 ℃靜置培養。分別于72 h以及96 h搖動一次，120 h時測定酶活性。發酵結束后固體產酶培養基中加滅菌蒸餾水100 mL，搗碎，28 ℃搖床振蕩浸提1 h，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，上清液為粗酶液。

1.2.2 硫酸銨沉淀蛋白 向葡萄糖淀粉酶粗酶液中加入硫酸銨，不斷地緩慢攪拌，直至硫酸銨濃度達到80 %飽和度，置于4 ℃冰箱過夜；10 000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀蛋白用蒸餾水溶解，透析后用于測定粗酶的酶學性質。

1.2.3 酶活測定[13] 底物為用0.1 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液體配制的1%可溶性淀粉溶液。25 mL刻度試管中加底物0.9 mL，在測定溫度下預熱10 min，加0.1 mL適當稀釋的粗酶液準確反應5 min，加2 mL DNS溶液，煮沸5 min，流水冷卻，稀釋至25 mL，540 nm測定吸光值。1 h 釋放1 mg 還原糖（以葡萄糖計）的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.4 最適反應溫度和熱穩定性[14] 于不同溫度下測定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計算相對酶活，尋找酶的最適反應溫度。取適量酶液不同溫度下保溫，保溫結束立即置于冰水中冷卻，測定殘余酶活，研究酶的熱穩定性，以不經熱處理的酶活為100%。

1.2.5 最適反應pH和pH穩定性 分別用不同pH的磷酸緩沖液配制可溶性淀粉溶液，測定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計算相對酶活，尋找最適反應pH。取適量酶液分別在不同pH緩沖液中30 ℃保溫6 h，測定殘余酶活，研究酶的pH穩定性；以未處理的酶活力為100%，計算相對酶活。

1.2.6 金屬離子對酶活力的影響[14] 在反應體系中分別加入（鹽酸鹽或硫酸鹽）Cu2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Na+，使其終濃度為2 mmol/L，室溫下靜置30 min，測定酶活；以不加金屬離子的空白對照酶活為100%。

1.2.7 酶解產物的薄層層析[15] 在0.5 mL 1%可溶性淀粉中加入適當稀釋的硫酸銨沉淀的酶液0.1 mL，30 ℃反應1 h，然后在硅膠板上進行薄層層析，展開液為丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2，碘缸內染色24 h。

2 結果與分析

2.1 酶活性

對2種鐮刀菌進行固體培養并測定酶活性，以實驗室保存的一株黑曲霉為對照，結果如圖1所示。黑曲霉葡萄糖淀粉酶酶活為1 206 U/g，串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌分別為783 U/g以及1 065 U/g，比黑曲霉低。

2.2 淀粉酶對淀粉的酶解產物分析

對硫酸銨沉淀后的粗酶酶解可溶性淀粉的產物進行薄層層析，結果表明，葡萄糖是惟一可見的酶解產物（圖2），此作用方式為典型的葡萄糖淀粉酶的作用方式，因此串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產生的淀粉分解酶主要為葡萄糖淀粉酶。

2.3 葡萄糖淀粉酶的最適反應溫度

不同溫度下測定2種鐮刀菌所產葡萄糖淀粉酶的活性（圖3），結果顯示此酶在50～60 ℃范圍內酶活性最高，30～50 ℃有70%以上的活性，溫度達到60 ℃時以上酶活性降低。

2.4 葡萄糖淀粉酶的熱穩定性

串珠鐮刀菌產生的葡糖淀粉酶在40 ℃以下很穩定（圖4），40 ℃保溫90 min酶活性基本沒有損失；50 ℃保溫酶活損失很快，保溫90 min損失70%以上；60 ℃條件下酶活迅速喪失，保溫10 min酶活性已經損失90%以上，表明此酶的熱穩定性較差。

禾谷鐮刀菌所產葡萄糖淀粉酶與串珠鐮刀菌所產酶的熱穩定性基本一致（圖5），可能是由于兩株菌進化關系較近，所產酶的結構也可能較為類似，因此導致其熱穩定性基本一致。

2.5 酶的最適反應pH

對葡萄糖淀粉酶的最適反應pH研究結果發現（圖6），串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌葡萄糖淀粉酶最高酶活出現在pH 5.0附近，微酸性環境中酶活性較高，pH小于4.0時酶活性迅速下降。

2.6 葡萄糖淀粉酶的pH穩定性

研究了2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的pH穩定性（圖7），結果表明，2種酶在pH 5.0～7.0之間穩定性較好，pH 5.0～7.0之間30 ℃放置6 h酶活性保持90%以上，pH 4.0以下酶活性喪失較快。

2.7 不同金屬離子對2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性的影響

研究了不同金屬離子對葡萄糖淀粉酶活性的影響（圖8），結果發現，Mn2+、Cu2+對2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性都有較強的激活作用，其中Mn2+激活作用最強烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對照的176%和173%。Na+、Ca2+、Fe2+對酶活性有抑制作用；而K+、Mg2+、Zn2+對酶活性有輕微激活作用。

3 討論

有關曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學性質的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的半裸鐮刀菌[11]、尖孢鐮刀菌[11]、茄腐皮鐮刀菌[12]、蔗草鐮刀菌[12]、串珠鐮刀菌[16，17]等產葡萄糖淀粉酶也有報道，不同來源的酶性質存在很大差異。

茄腐皮鐮刀菌[12]產的葡萄糖淀粉酶在50 ℃時穩定，50 ℃保溫60 min 酶活性仍保留79%；Tochukwu等[14]篩選的一株鐮刀菌所產葡萄糖淀粉酶在40～70 ℃之間酶活性都比較高，最高酶活出現在50 ℃，而且熱穩定性非常高，70 ℃保存30 min酶活性仍保留78%；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[9]的最適反應溫度分別為30 ℃和40 ℃。本試驗中2種鐮刀菌在50 ℃時有最高酶活性，50～60 ℃之間酶活性較高；然而熱穩定性較差，50 ℃保溫1 h酶活力剩余不到50%，其最適反應溫度以及熱穩定性與報道的曲霉菌及鏈霉菌屬中葡萄糖淀粉酶的性質較為相近[7，8]。

真菌葡萄糖淀粉酶的最適反應pH多為酸性，而且一般在酸性及中性pH時穩定[8，12，14]。茄腐皮鐮刀菌[12]在pH 3.0～5.0有較高的酶活性；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[18]分泌淀粉酶的最適反應pH為6.9； Tochukwu等[14]篩選的鐮刀菌在pH 6.5～8.5有較高的酶活性，pH 4.5～7.0穩定。而本試驗結果表明，禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌在弱酸性條件下酶活性較高，最高酶活性出現在pH 5.0～6.0。在本研究pH 5.0～7.0條件下酶活性都保留90%以上，pH 4.0以下處理酶活性喪失很快。

大部分淀粉酶的活性都需要有金屬離子的參與，特別是二價金屬離子對淀粉酶的活性有激活作用。文獻報道真菌葡糖淀粉酶一般被Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+等不同程度地激活[9，10，12]，但不同金屬離子對不同來源的酶的作用有所差異[5]。茄腐皮鐮刀菌[12]葡萄糖淀粉酶酶活性被Cu2+、Mg2+激活，被Hg2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+以及Fe3+抑制；Tochukwu等[14]篩選的菌株所產酶被Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等激活，被Mn2+以及Fe2+抑制。本試驗中，Mn2+、Cu2+對2種鐮刀菌都有較強的激活作用，其中Mn2+激活作用最為強烈，Na+、Ca2+、Fe2+對酶活性有抑制作用。

可見，不同來源的菌株所產的葡萄糖淀粉酶性質不同，通過對不同菌株的篩選研究發掘不同性質的酶可以應用于不同的行業。本試驗對禾谷鐮刀菌以及串珠鐮刀菌所產生的葡萄糖淀粉酶的部分酶學性質進行了研究，以期對這2種菌葡萄糖淀粉酶的開發利用提供一定的借鑒作用。

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