青海省胡盧巴根瘤菌的抗逆性

摘要：從青海省的西寧、大通和樂都各城區采集豆科植物胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）的根瘤，經分離、純化、鏡檢、回接獲得10株未知菌株，對獲得的根瘤菌進行耐鹽、耐酸堿、抗生素抗性和溫度敏感性等抗逆性測定。結果表明，供試菌株對酸堿的耐性比較強，所有菌株都能在pH 5～9的范圍內生長；供試菌株耐鹽性較強，有4株菌株能在40 g/L NaCl上生長，其中1株菌株能在50 g/L NaCl上生長；對溫度的適應范圍較寬；各菌株對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異。篩選出3株耐鹽、耐酸堿、生長溫度范圍廣和抗生素抗性較強的菌株，分別為QXT805、QXT808、QXT809。

關鍵詞：根瘤菌；抗逆性；胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）；青海省

中圖分類號：Q939.11+4；S542 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6020-03

根瘤菌是一類與農業生產關系甚為密切的革蘭氏陰性桿狀細菌。它們與豆科植物共生，通過侵染豆科植物根部或莖部形成根瘤和少數莖瘤，將空氣中的氮氣轉化為氨，進而轉化成植物可吸收利用的優質氮素——谷氨酸和谷氨酰胺類物質[1]。由于青藏高原干燥、多風、寒冷、缺氧等特殊生態環境的長期作用，使得該地區的植物較其他低海拔地區的植物在形態結構和生理生化等方面都有很大的差異，反映在豆科植物的根瘤菌上也有很大的差異性，尤其是抗逆性方面值得深入研究。胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）是西部地區栽培利用時間較長的豆科植物，在青海省分布廣泛，資源豐富，其經濟價值很高，具有廣闊的應用前景[2]。近年來對胡盧巴的研究多為藥用和香料方面[3]，但對其根瘤菌抗逆性研究鮮見報道。本試驗研究了胡盧巴根瘤菌的耐鹽性、耐酸堿性、溫度敏感性和抗生素抗性，以期為青海省胡盧巴等栽培植物的根瘤菌資源保護和開發利用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從青海省西寧、大通、樂都的農田采集栽培的初花期豆科植物胡盧巴根瘤，從采集的根瘤中獲得了93個分離物樣品，經純化、鏡檢、初步鑒定和結瘤試驗篩選出10株待測菌株，這些菌株均來自西寧地區，具體見表1。

1.2 培養基

YMA液體培養基：蔗糖10.0 g，甘露醇10.0 g，酵母膏2.0 g， K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加蒸餾水定容至1 000 mL ，pH 7.0～7.4。

1.3 根瘤菌抗逆性試驗

1.3.1 耐酸堿性試驗[4] 以pH 7的YMA液體培養基為基礎培養基，用HCl或NaOH調節培養基pH分別為5、6、7、8、9，以pH 7的YMA液體培養基為對照，20 ℃培養2～3 d。各處理均設3次重復。

1.3.2 耐鹽性試驗[5] 將供試菌株分別接種于NaCl濃度分別為1、5、10、20、30、40、50 g/L的YMA液體培養基上培養，以不加NaCl的YMA液體培養基為對照，20 ℃培養2～3 d。各處理均設3次重復。

1.3.3 溫度敏感性試驗[4] 將接種供試菌于4、20、41、50、65 ℃（其中41、50、65 ℃處理是將菌株分別在相應溫度下水浴處理30 min后于20 ℃下繼續培養）的條件下培養2～3 d，以20 ℃為對照。各處理均設3次重復。

1.3.4 抗生素抗性試驗[6] 將供試菌株分別接種于含白霉素、林可霉素、頭孢匹林鈉、氨芐青霉素、阿米卡星的YMA液體培養基中培養，各抗生素終濃度分別設定為5、50、100、300 mg/L，以不接種抗生素的YMA液體培養基為對照，20 ℃培養2～3 d。各處理均設3次重復。

2 結果與分析

2.1 胡盧巴根瘤菌的耐酸堿性

pH對根瘤菌生長的影響結果（表2）表明，供試菌株均能在pH 5～9的YMA液體培養基上生長，在pH 7時各菌株長勢好，在pH 5、pH 6和pH 9的培養液中除菌株QXT610長勢好外，其余菌株的長勢一般。菌株QXT807和QXT808在pH 6～9均有菌膜或菌環，菌株QXT809的培養液隨pH的增大顏色趨向綠色，顯示出與其他菌株的差異性。

2.2 胡盧巴根瘤菌的耐鹽性

耐鹽性測定結果（表3）表明，供試菌株表現出不同程度的耐鹽性。所有菌株均能在含1 g/L和5 g/L NaCl的YMA液體培養基上生長；菌株QXT607、QXT609和QXT611的耐鹽性較差，在含10 g/L NaCl的YMA液體培養基上已不能生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809、QXT810和QXT603均能在含30 g/L NaCl的YMA液體培養基上生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809均能在含40 g/L NaCl的YMA液體培養基上生長；菌株QXT809還能在含50 g/L NaCl的YMA液體培養基上生長，表現出了很強的耐鹽性。表明分離自同一地區不同生長時期的胡盧巴根瘤菌在耐鹽性方面也存在一定的差異性。

2.3 胡盧巴根瘤菌的生長溫度范圍

溫度對根瘤菌生長的影響的測定結果見表4。由表4可知，供試菌株均能在20 ℃和41 ℃的條件下生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809、QXT810均能在50 ℃下生長；菌株QXT805還能在65 ℃和4 ℃下生長，表現出較強的耐高溫和低溫的特性，對溫度的適應范圍寬；菌株QXT808和QXT809能在4 ℃的低溫條件下生長，表現出耐低溫的特性，這與其生長的環境因素有一定的關系。

2.4 胡盧巴根瘤菌的抗生素抗性

供試菌株對5種抗生素的天然抗藥性測定結果見表5。由表5可知，所有供試菌均對白霉素（5、50、100 mg/L）、林可霉素（5、50 mg/L）、頭孢匹林鈉（5、50、100 mg/L）， 氨芐青霉素（5、50 mg/L）表現出抗性，對阿米卡星（5、50、100、300 mg/L）敏感。70%的菌株對100 mg/L林可霉素表現出抗性，50%的菌株對300 mg/L林可霉素表現出抗性， 60%的菌株對300 mg/L頭孢匹林鈉、100 mg/L氨芐青霉素表現出抗性。菌株QXT807和QXT809對300 mg/L白霉素表現出抗性，菌株QXT809對300 mg/L氨芐青霉素仍表現出抗性。說明各菌株對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異。

3 結論

通過對青海省胡盧巴根瘤菌的抗逆性測定，結果顯示，菌株QXT809能夠在50 g/L NaCl的YMA液體培養基上生長，表現出了很強的耐鹽性。所有供試菌株在pH 7條件下長勢較好，菌株QXT809的培養液隨pH的增大顏色趨向綠色，顯示出與其他菌株的差異性。有5株菌株均能在50 ℃條件下生長，菌株QXT805既能在65 ℃下生長，又能在4 ℃下生長，表現出較強的耐高溫和低溫的特性，對溫度適應范圍廣； 菌株QXT808和QXT809能在4 ℃的低溫條件下生存，表現出耐低溫的特性。供試菌株對抗生素抗性的測定結果表明，各菌株間對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異，即使是來自同一地區同一生長時期的菌株間也有差異。篩選出了3株耐鹽、耐酸堿、生長溫度范圍廣和抗生素抗性較強的菌株，分別為QXT805、 QXT808、 QXT809。這可能與其長期生長在青藏高原干燥、多風、寒冷、缺氧等的特殊生態環境中有一定的關系。研究結果表明，分離自不同地區、不同生長時期宿主的胡盧巴根瘤菌是一個復雜的群體，抗逆性方面表現出了豐富的多樣性。

參考文獻：

[1] FAO. Technical Handbook on Symbiotic Nitrogen Fixation Legume/Rhizobium[M].Rome， Italy： FAO，1983.

[2] 張 慧，劉 力，曾玲力，等.GC-MS法測定胡蘆巴籽中脂肪酸成分的含量[J].新疆醫科大學學報，2003（3）：284.

[3] 中國醫學科學院藥物研究所.中藥志（第三冊）[M].北京：人民衛生出版社，1961.

[4] 陳今朝，張 紅，顧素芳，等.培養條件對篩選根瘤菌突變體的影響[J].中國微生態學雜志，1999，1（6）：346-348.

[5] 吳 建，楊蘇聲，李季倫.苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）的耐鹽性研究[J].微生物學報，1993，33（4）：260-267.

[6] 刁治民，馮廷花.蠶豆根瘤菌抗藥性菌株的篩選[J].青海畜牧獸醫雜志，1994，24（6）：22-24.