草莓新品種晶玉高效離體再生體系的建立

摘要：以草莓新品種晶玉為試材，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和配比對其葉片、葉柄再生的影響及不同暗培養(yǎng)時間對葉片再生的影響，并篩選出了最佳的生根培養(yǎng)基，建立了晶玉的高效離體再生體系。結(jié)果表明，培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D對晶玉葉片不定芽的分化效果最好，平均不定芽再生率可達81.45%，每葉塊平均再生芽數(shù)達到4.47個；暗培養(yǎng)7 d有利于葉片不定芽的再生。培養(yǎng)基MS+3.0 mg/L TDZ +0.05 mg/L 2，4-D對晶玉葉柄不定芽再生的效果最好。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA。

關鍵詞：草莓；晶玉；離體再生；葉片；葉柄

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5912-05

晶玉是湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所以甜查理為母本，晶瑤為父本雜交選育的草莓新品種，于2012年通過湖北省農(nóng)作物品種審定委員會的審定[1]。該品種具有品質(zhì)較優(yōu)、抗炭疽病和白粉病、豐產(chǎn)性好等優(yōu)勢，是生產(chǎn)上很有潛力的一個栽培品種。建立其高效的再生體系，對于草莓品種的種質(zhì)交換及進一步的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義[2，3]。

國內(nèi)外對草莓的組織培養(yǎng)再生研究已有一些報道，主要集中在對草莓莖尖快速繁殖，不同品種的葉片、葉柄、花藥不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相關研究中涉及的品種主要是豐香、晶瑤、Tudla、全明星、紅顏等[7-12]，但具有高效再生體系的優(yōu)良草莓品種仍然較少，有必要進一步對新審定的草莓品種進行高效再生體系研究。本研究以晶玉葉片、葉柄為試材，研究了不同激素濃度和配比對葉片、葉柄不定芽分化的影響，暗處理對不定芽分化的影響等，建立了草莓新品種晶玉的高效離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為草莓新品種晶玉，2011年4月種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所草莓試驗圃，6月在田間選取健壯草莓母株上，生長充實而小葉尚未展開的匍匐莖頂端約3～4 cm長的頂芽。

1.2 無菌材料的獲得

將匍匐莖頂芽用自來水沖洗干凈并擦干，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，按下列程序消毒。70%酒精浸潤30 s，無菌水沖洗1次，然后用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗5次。將處理好的頂芽在無菌紙上逐層剝?nèi)ビ兹~取出莖尖生長點，接于MS培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d（下同）。莖尖在MS培養(yǎng)基上成活后，在MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次，以25 d苗齡無菌試管苗的葉片、葉柄為試驗材料。

1.3 不同濃度6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

取長勢健壯、三出復葉均展開的晶玉無菌試管苗葉片，去除葉片邊緣部分，切成5 mm×5 mm左右的小塊狀葉盤，以近軸面向下與再生培養(yǎng)基接觸進行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L 蔗糖（Sucrose）+ 2.5 g/L 菲特膠（Phytagel）為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IAA激素配比，50 d后進行觀察統(tǒng)計，研究不同濃度的6-BA與IAA組合對晶玉草莓葉片不定芽再生的影響。每個處理80片葉，每處理3次重復。接種后培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃、光照度 1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d（除暗培養(yǎng)外，下同）。

1.4 不同濃度TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養(yǎng)方法，以MS+ 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的噻苯?。═DZ，Thidiazuron）與0.05、0.10、0.20 mg/L 的2，4-D激素配比，50 d后進行觀察統(tǒng)計，研究不同濃度的TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.5 不同濃度TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養(yǎng)方法，以MS+30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基， pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的TDZ與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IBA激素配比，50 d后進行觀察統(tǒng)計，研究不同濃度的TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.6 不同暗培養(yǎng)時間對晶玉葉片不定芽再生的影響

以MS + 2.0 mg/L TDZ + 0.05 mg/L 2，4-D + 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為培養(yǎng)基，pH 5.8，葉盤接種后在（25±2） ℃條件下，分別進行0、7、14、21、28 d的暗處理，在光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d的條件下培養(yǎng)，研究不同暗培養(yǎng)時間對晶玉葉片不定芽再生的影響。每個處理80片葉，每處理3次重復。

1.7 不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響

取長勢健壯、三出復葉均展開的晶玉無菌試管苗葉柄，切成1 cm左右的小段與再生培養(yǎng)基接觸進行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L Sucrose+2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別添加不同濃度的TDZ與2，4-D或IBA的配比，50 d后進行統(tǒng)計，研究不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響。每個處理80個葉柄切段，每處理3次重復。接種后培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d。

1.8 晶玉的再生小苗生長與植株生根

將再生的晶玉不定芽在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA上繼代培養(yǎng)1次，當不定芽長至3 cm左右時，將生長健壯的無根小苗接種于不同生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25 d后進行觀察統(tǒng)計。通過生根率、平均生根數(shù)、平均根長、平均根粗等指標綜合衡量晶玉的最佳生根培養(yǎng)基。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在不定芽再生過程中，持續(xù)觀察外植體形態(tài)變化及不定芽再生情況。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計不同處理不定芽再生頻率和每個外植體再生的不定芽個數(shù)，計算不定芽再生率及每個外植體再生芽數(shù)。

不定芽再生頻率=再生出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%

每個外植體再生芽數(shù)=外植體再生出的不定芽總數(shù)/再生出不定芽的外植體數(shù)

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進行分析，應用SAS 8.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

晶玉葉盤接種于添加了6-BA與IAA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，愈傷產(chǎn)生量少，且愈傷多為淺綠色、質(zhì)地較致密堅硬，30 d左右不定芽開始分化。大部分不定芽經(jīng)愈傷組織分化形成，少量不定芽直接在葉片切口末端形成。如表1所示，不同濃度的6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的試驗中，該組合總體上能夠誘導葉片不定芽的再生，但再生頻率較低。其中2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA組合對晶玉葉片不定芽再生相對較好，再生率達到19.05%，與其他處理間差異顯著。

2.2 不同濃度TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

從表2可以看出，在同一TDZ水平上，晶玉葉片不定芽再生率隨著2，4-D濃度的升高呈顯著下降的趨勢，這說明培養(yǎng)基中附加低濃度（小于0.10 mg/L）的2，4-D有利于晶玉葉片不定芽的再生。葉片接種于添加了TDZ與2，4-D不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，產(chǎn)生愈傷多為黃綠色顆粒狀，質(zhì)地較致密，25 d左右開始形成不定芽。結(jié)果表明，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生最好，再生率達到81.45%，顯著高于其他處理，平均再生芽數(shù)達到4.47個。3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合不定芽再生率也較高，但觀察發(fā)現(xiàn)，當TDZ濃度較高時（大于2.0 mg/L），再生出的不定芽玻璃化嚴重，因此TDZ濃度不宜過高，以2.0 mg/L為宜。如圖1所示，圖1a為晶玉葉片接種7 d后在切口邊緣形成明顯的黃綠色愈傷，圖1b為晶玉葉片愈傷再生出的不定芽。

2.3 不同濃度TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

在TDZ與IBA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上，晶玉葉片多產(chǎn)生黃綠色顆粒狀愈傷、少量為塊狀，質(zhì)地致密，30 d左右開始形成不定芽。從表3可以看出，2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA組合對培養(yǎng)晶玉葉片不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達到55.96%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數(shù)達到3.55個；當TDZ濃度進一步提高到3.0 mg/L時，不定芽再生率開始下降，且不定芽以叢生狀為主，長勢較弱，玻璃化現(xiàn)象嚴重。

2.4 不同暗培養(yǎng)時間對晶玉葉片不定芽再生的影響

不同暗培養(yǎng)時間對晶玉葉片不定芽再生的影響如表4所示。暗培養(yǎng)7 d平均不定芽再生率最高，達到84.53%，每個外植體再生芽數(shù)達到5.01個，顯著高于沒有暗培養(yǎng)的處理，表明暗培養(yǎng)對晶玉葉片不定芽的再生有一定促進作用。觀察發(fā)現(xiàn)，進行7 d暗培養(yǎng)，可以減輕晶玉葉片切口的褐化現(xiàn)象，這可能是暗培養(yǎng)促進不定芽再生的主要原因。但暗培養(yǎng)時間過長不利于不定芽的分化再生。

2.5 不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響

不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響結(jié)果如表5所示。在13種激素組合中，3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉柄不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達到57.83%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數(shù)達到3.59個。晶玉葉柄不定芽再生如圖1所示，其中圖1c為晶玉葉柄接種7 d后在切段兩端形成明顯的黃綠色塊狀愈傷，圖1d為葉柄愈傷再生不定芽。

2.6 不同生根培養(yǎng)基對晶玉植株生根的影響

再生出來的晶玉不定芽在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)1次后生長成小植株，如圖1e所示。在如表6所示的7種生根培養(yǎng)基中，從各項指標綜合考慮，晶玉的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA，其生根率、平均生根數(shù)、平均根長、平均根粗分別達到了99.33%、11.67個、3.04 cm、0.80 mm。晶玉不定芽生根形成的完成植株如圖1f所示。

3 小結(jié)與討論

影響草莓再生的因素較多，其中草莓品種自身特性、培養(yǎng)基、不同激素的種類和濃度配比等是關鍵因子。近幾年，湖北省草莓育苗期炭疽病病害發(fā)生嚴重[13]，而晶玉是一個對炭疽病具有較高抗性的品種，其在生產(chǎn)上應用潛力較大。晶玉高效的再生體系對于種質(zhì)交換及進一步的草莓遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。

激素種類和配比是影響外植體器官發(fā)生的重要因素。在離體培養(yǎng)中一般生長素有利于根的形成，而細胞分裂素有利于芽的形成，通過改變二者的比例可以調(diào)節(jié)芽的形成。在不同類型的激素組合中，以TDZ與2，4-D配合使用時晶玉再生頻率較高，這可能與TDZ強烈的細胞分裂素活性有關。本試驗建立了晶玉的高效離體再生體系，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的效果最好，再生率達到81.45%；3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉柄不定芽再生的效果最好，再生率達到57.83%。

暗培養(yǎng)也是影響草莓葉片再生率高低的重要因素之一。有相關報道指出[9，14，15]，草莓不同品種再生所需要的合適的暗培養(yǎng)時間各有不同，草莓豐香的最佳暗培養(yǎng)時間是14 d，草莓吐德拉是21 d，草莓幸香是42 d。本研究結(jié)果表明，晶玉葉片再生最佳的暗培養(yǎng)時間是7 d。暗培養(yǎng)的主要作用是讓外植體在再生過程中減少溢出酚類物質(zhì)，減輕褐化，維持植物材料較好的生理狀態(tài)[16，17]，因而有利于再生。

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