植物生長調節劑對槲蕨離體培養的效

摘要：以不同來源的槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]孢子、塊莖、葉片為試驗材料，在培養基中加入不同濃度的6-BA、2，4-D、NAA、IBA等激素，研究植物生長調節劑對槲蕨離體培養的效應。結果表明，適當濃度的2，4-D對槲蕨愈傷組織誘導有良好的促進作用，且愈傷組織較大、嫩綠、質量好，愈傷組織誘導最佳激素組合為1.0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L 2，4-D，誘導率為53.3%；最佳分化培養基為1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT，分化率為75.0%；繼代增殖中6-BA與NAA配比有較好的效果，最適增殖培養基為2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA，最高增殖倍數可達2.25倍；最佳生根壯苗培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA。

關鍵詞：植物生長調節劑；槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]；離體培養；效應

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5909-03

槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]為槲蕨科（Drynariaceae）槲蕨屬（Drynaria）植物，其根莖是中藥骨碎補的主要來源，具有補腎強骨、續傷止痛等功效，常用于治療腎虛腰痛、耳鳴耳聾、牙齒松動、跌撲閃挫、筋骨折傷、外治斑禿及白癜風[1]等疾病。槲蕨的多糖還具有一定的抗細菌和真菌活性[2]。以槲蕨為原料的強骨膠囊已獲國家藥品監督管理局頒發的中藥二類新藥證書和生產批文并開始生產[1]。槲蕨主要分布在長江以南各省，附生于低山丘陵的巖石或樹干上。槲蕨分布和數量相對較少，但需求量大，槲蕨占骨碎補商品藥材的70%以上[3]。近年來，隨著人們保健意識的增強，對原料的需求急劇增加，加上生態環境的變化和骨碎補的大量被采挖，使該植物的種類和數量越來越少，在一些地區骨碎補瀕危滅絕，野生槲蕨緊缺。目前，國內外對槲蕨的研究主要集中在化學成分、藥理及生藥鑒定等方面，有關于消毒方式、光照度等對槲蕨組培快繁的影響的報道[4-6]，而對槲蕨不同部位離體培養的研究報道較少。本試驗通過研究植物生長調節劑對槲蕨不同部位外植體離體培養的效應，旨在為槲蕨的組培快繁以及開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料槲蕨孢子、塊莖采自廣西武鳴縣、玉林市及四川等地。2011年4月11日于廣西藥用植物園離體庫進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 取槲蕨幼嫩孢子、塊莖、葉片，先用洗潔精水溶液清洗塊莖表面污垢，清除塊莖表皮毛，置于燒杯中流水沖洗15 min，用軟毛刷輕輕去除表面塵土，然后移至超凈工作臺上，用75%乙醇滅菌25～30 s，無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水浸泡4次，每次5 min。用備用的無菌濾紙吸干外植體表面的水分后，剪切成大小約1.0 cm×0.6 cm、厚為0.2～0.3 cm的塊莖，葉片大小為1.0 cm×0.6 cm，平放到培養基上，孢子用消毒好的解剖刀從葉片上刮到培養基中，塊莖和葉片每瓶接種2～4個外植體。每處理接種20瓶，3次重復，取平均值。

1.2.2 培養基的選擇 愈傷組織誘導及分化培養基是以MS為基本培養基，設不同激素配比共12種，分別為：（0.5、1.0） mg/L 6-BA +（0.5、1.0、1.5）mg/L 2，4-D；（0.5、1.0） mg/L 6-BA+（0.1、0.5、1.0）mg/L KT；繼代增殖培養基設不同激素配比10種，分別為：（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA；2.0 mg/L 6-BA +（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0）mg/L NAA；生根培養基以1/2 MS為基本培養基，設不同激素配比4種，分別為：0.5 mg/L IBA、0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L IAA、0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA。

1.2.3 培養條件 接種后，在溫度20～25 ℃、光照度20～30 μmol/（m2·s）、光照時間12 h/d的條件下進行愈傷組織誘導分化、繼代增殖與壯苗生根培養。

2 結果與分析

2.1 不同激素水平對槲蕨愈傷組織誘導的影響

采用12種不同的激素配比對消毒好的槲蕨幼嫩孢子、塊莖、葉片進行愈傷組織誘導及分化，首先將外植體接種到愈傷組織誘導培養基中培養（圖1A），再對愈傷組織進行分化培養（圖1B）。經試驗觀察發現，孢子培養（圖1C）7 d左右開始呈綠色，隨后便長出大小不一的葉叢（圖1D）；葉片則逐漸褐化；只有塊莖產生愈傷組織。塊莖愈傷組織誘導效果見表1。

從表1可以看出，A1-A12處理均能使槲蕨誘導產生愈傷組織并分化，A1-A6處理是0.5、1.0 mg/L 6-BA分別與0.5、1.0、1.5 mg/L 2，4-D配合使用，其中1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L 2，4-D配對組合槲蕨愈傷組織誘導率較高，為53.3%，愈傷組織嫩綠（圖1A）；繼續培養5～10 d愈傷組織便可分化出葉叢（圖1B）。

A7-A12處理是0.5、1.0 mg/L 6-BA分別與0.1、0.5、1.0 mg/L KT配合使用，槲蕨產生的愈傷組織數較少，最高愈傷組織誘導率僅為35.7%，相對而言，愈傷組織質量變差，部分出現淺黃色或褐化現象。可見，適當濃度的2，4-D對槲蕨愈傷組織誘導效果優于KT。而在分化培養中，KT對槲蕨愈傷組織的分化起到促進作用，其最高分化率可達75.0%。

2.2 不同激素水平對槲蕨苗繼代增殖的影響

均等切分誘導出的槲蕨葉叢，將其接種在含不同外源激素水平的增殖培養基上，30 d后統計和觀察增殖情況。試驗結果（表2）表明，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA配合使用對槲蕨葉叢的增殖有明顯的促進作用。在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA的濃度梯度范圍內，槲蕨葉叢增殖系數不斷增加，試驗中觀察發現在B7培養基上槲蕨繼代苗生長良好，葉片濃綠，苗生長較整齊一致（圖1E），且增殖倍數達到最大，為2.25倍；在6-BA濃度不變的情況下，隨著NAA濃度的增加，槲蕨葉叢增殖系數呈下降趨勢，且苗質量變差，葉片枯黃現象較為嚴重。

2.3 不同激素水平對槲蕨繼代苗生根的影響

將槲蕨繼代苗接入含不同外源激素水平的生根培養基上培養，20 d后觀察，根據統計結果得出4種生根培養基上的誘導情況，槲蕨根粗大小依次為D4、D3、D2、D1；4種生根培養基的苗都呈濃綠色，有少數苗根部枯黃，生根率均達90%以上。從表3可以看出，NAA誘導出的根無論根粗和苗高都優于IBA，激素NAA和IAA配比對槲蕨壯苗生根的效果較好，最佳生根培養基為1/2 MS+0.5 mg/LNAA+0.3 mg/L IAA。

2.4 試管苗的移栽

經過壯苗生根培養后，選擇健壯、根粗的試管苗進行煉苗。打開培養瓶的蓋子，噴施少量水，放入溫室內自然光下煉苗7 d，用鑷子取出試管苗，洗凈根部培養基，移栽到基質約為5～8 cm厚的泥炭土、樹皮等基質中，基質以排水良好、不易發霉為宜。移栽至苗較粗壯，長勢旺盛時，可移植到樹上（圖1F）。

3 小結與討論

本研究分別采用槲蕨孢子、塊莖和葉片進行愈傷組織誘導對比試驗，發現孢子放到培養基中培養，出現綠點進而形成葉叢團；塊莖能夠誘導出愈傷組織，但愈傷組織誘導率較低；葉片在誘導過程中易褐化，未產生愈傷組織。

植物生長調節劑對槲蕨的離體培養有較大影響，此外，離體培養還受光照、溫度、活性炭等因素的影響，適當調整光暗條件進行培養對于塊莖愈傷組織的產生有促進作用，本試驗在槲蕨愈傷組織誘導初期進行了光暗交替培養，對于愈傷組織的產生有一定的促進作用。

試驗中發現，在添加活性炭之前，槲蕨苗培養1個月后底部逐漸黃化或褐化，苗細弱；添加活性炭以后，槲蕨苗褐化現象少，且幼苗健壯。說明活性炭有利于壯苗及抑制褐化。

參考文獻：

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[2] 蘇育才.槲蕨多糖的分離及抗菌活性的初步研究[J].微量元素與健康研究，2005，22（4）：25-26.

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