甘薯濟黑1號莖尖脫毒與快繁技術(shù)研究

摘要：以甘薯（Ipomoea batatas L.）濟黑1號為試材，對濟黑1號莖尖脫毒和脫毒苗快繁技術(shù)進行研究，并用指示植物法對再生植株無性系進行病毒檢測。結(jié)果表明，在薯塊出芽30 d內(nèi)，外植體的處理中采用2%的NaClO溶液處理最好，接種于含有1 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，取材污染率最低，成苗率最高。快繁過程中普通MS培養(yǎng)基中加入0.02 mg/L IAA對快繁更加有利。

關(guān)鍵詞：甘薯（Ipomoea batatas L.）；脫毒；莖尖；快繁

中圖分類號：S531 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5887-02

甘薯（Ipomoea batatas L.）為無性繁殖作物，是我國四大糧食作物之一。甘薯體內(nèi)病毒的積累可造成品種種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量降低，同時導(dǎo)致甘薯商品率明顯降低，對甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。國內(nèi)外迄今尚未育出高抗病毒病的實用甘薯品種，也無防治病毒病的高效農(nóng)藥。目前利用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒甘薯已成為防治病毒病，提高甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)的首選方法。莖尖分生組織培養(yǎng)要求技術(shù)性強，難度較大，再生植株的成苗受甘薯品種、培養(yǎng)基與激素等多種因素的影響，導(dǎo)致成苗率普遍比較低[1]。

本研究以目前紫薯加工領(lǐng)域中需求越來越大的紫甘薯濟黑1號為試材，探索影響甘薯濟黑1號莖尖分生組織培養(yǎng)和試管苗快繁的有關(guān)因素，為工廠化快速繁育甘薯脫毒苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

濟黑1號由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所甘薯育苗圃；常規(guī)藥品與試劑均購自北京國藥試劑廠。

1.2 試驗方法

取薯塊上萌發(fā)的芽苗作為外植體材料，將2～3 cm左右的外植體放入小培養(yǎng)皿中，加入洗潔精反復(fù)沖洗，然后用自來水沖洗直至無洗潔精殘留。將培養(yǎng)皿放在超凈工作臺內(nèi)，加70%乙醇處理30 s，滅菌水反復(fù)沖洗2次以上，2%NaClO溶液消毒5 min，滅菌水反復(fù)沖洗3次后至無殘留，備用[4]。

將滅菌后的材料在解剖鏡下取帶有1～2個葉原基的莖尖分生組織，分別接種于MS基本培養(yǎng)基+1 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基，植株再生后，分別移植到普通培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+9 g/L瓊脂、pH 5.8）和再生培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+0.02 mg/L IAA +30 g/L蔗糖+9 g/L瓊脂、pH 5.8）進行快繁。培養(yǎng)條件為：溫度（28±2）℃，光照度2 000～3 000 lx， 光照時間12～16 h/d，空氣濕度控制在50%以下。

1.3 甘薯脫毒苗的檢測

1.3.1 目測法 根據(jù)甘薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘薯是否帶毒。甘薯葉片上病毒病的癥狀主要包括：葉片斑點型、花葉型、卷葉型、皺縮型、黃化型；薯塊上的癥狀主要是產(chǎn)生黑褐色或黃褐色龜裂紋。根據(jù)外觀癥狀作初步判斷，有以上癥狀表現(xiàn)的植株和薯塊就不能作為接種材料，但是有些潛隱性病毒侵染植物后并不表現(xiàn)明顯的癥狀，此方法作為一種輔助手段進行初步判斷[2]。

1.3.2 指示植物法 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，cDNA探針和雙鏈RNA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多種植物的病毒檢測。但目前因難以設(shè)計構(gòu)建引物，故此仍采用廉價可靠的指示植物法（常用巴西牽牛作為指示植物）。本試驗采用的是巴西牽牛，其對多種侵染甘薯的病毒敏感，受侵染部位易產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理時間對甘薯成苗率的影響

外植體消毒對組織培養(yǎng)至關(guān)重要，甘薯的外植體消毒選擇2%的NaClO溶液處理5 min。在莖生長周期未超過1個月時取材最好，隨著周期的延長污染苗數(shù)增加，在污染苗數(shù)增加后，延長NaClO溶液消毒時間至7～10 min，試驗結(jié)果見表1。由表1可以看出，2%的NaClO溶液處理5 min時消毒效果最好，取材時間也應(yīng)控制在30 d內(nèi)，每10 d記錄一次，成苗率分別達(dá)到89%、84%和87%；隨著NaClO溶液消毒時間的延長，污染苗數(shù)逐漸降低，但成苗數(shù)也隨之降低，消毒時間延長對甘薯莖尖有所傷害。

2.2 不同培養(yǎng)基對甘薯再生與擴繁的影響

將濟黑1號莖尖分生組織接種于含有1 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，約10 d后莖尖分生組織開始膨大并轉(zhuǎn)綠；培養(yǎng)20 d左右莖尖形成2～3 mm的小芽點，肉眼可見小葉尖，莖尖基部同時形成黃綠色的愈傷組織；隨著培養(yǎng)時間的延長，莖尖伸長基部形成不定根，40 d莖尖長成小苗，基部有少量愈傷組織（圖1）。

從表2可以看出，在兩種培養(yǎng)基上甘薯脫毒試管苗的生長均良好，在不添加激素的MS培養(yǎng)基中濟黑1號脫毒試管苗的平均增殖倍數(shù)為3.3倍，在添加0.02 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基中，濟黑1號脫毒試管苗的增殖倍數(shù)為4.0，表明適當(dāng)添加IAA可以提高繁殖率。

2.3 甘薯脫毒效果的檢測

莖尖越小脫除病毒的效果越好，但莖尖越小誘導(dǎo)存活的難度就越大。特別是從田間或溫室采回的材料帶菌較多，培養(yǎng)時要經(jīng)過NaClO溶液的浸泡，75%的乙醇嚴(yán)格滅菌，對幼嫩生長點影響較大，導(dǎo)致其難以成活[5]。經(jīng)過前期大量試驗，采用1 mm左右的莖尖進行培養(yǎng)，成苗率最高，獲得健壯的再生苗后，再用斜接法，嫁接到巴西牽牛上進行病毒檢測。

3 小結(jié)

在薯塊出芽30 d內(nèi)，采用2%的NaClO溶液處理外植體5 min，取材污染率最低，成苗率最高。30 d后污染率逐漸增加。快繁過程中普通MS培養(yǎng)基中加入0.02 mg/L IAA對快繁更加有利。

參考文獻(xiàn)：

[1] 何新民，蔣 菁，唐洲萍，等.甘薯莖尖培養(yǎng)與脫毒技術(shù)研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（8）：964-968.

[2] 孟令文.甘薯莖尖脫毒及快繁技術(shù)研究[J].雜糧作物，2010， 30（6）：414-415.

[3] 李曉青，趙海紅，張曉申，等.甘薯商薯19莖尖脫毒技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（12）：67-69.

[4] 蘇文瑾，王連軍，雷 劍，等.激素組合對甘薯鄂薯6號莖尖愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（23）：5503-5504.

[5] 羅淑芳，謝國祿.甘薯種源試管中保存技術(shù)研究[J].國外作物育種，1994（4）：48-52.