海藻酸鈉固定化α—淀粉酶的研究

摘要：以海藻酸鈉為載體，采用包埋交聯法制備固定化α-淀粉酶，通過單因素試驗和正交試驗確定最優的固定化α-淀粉酶的條件。利用聚乙二醇4 000作為制孔劑，進一步制備具有多孔結構的固定化酶。結果表明，最優工藝為海藻酸鈉1.6%，α-淀粉酶0.4%，羧甲基纖維素鈉0.2%，CaCl2 2%，在此條件下，固定化α-淀粉酶的固定效率可達92.43%。在體系中添加濃度為2.5%的聚乙二醇4 000能使酶活性提高37.61個百分點，得到的固定化酶的溫度穩定性以及pH穩定性均優于游離酶。

關鍵詞：海藻酸鈉；固定化；α-淀粉酶；聚乙二醇

中圖分類號：Q814.2；TQ925+.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5845-05

α-淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍存在于動物、植物和微生物中，它能以隨機作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內的α-1，4葡萄糖苷鍵，產生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被廣泛應用于食品加工、糧食工業、乙醇工業、發酵和紡織業等多種行業，是工業生產中應用最為廣泛的酶制劑之一[1，2]。

固定化酶與游離酶相比，具有熱穩定性高、保存穩定性好、對變性劑耐受性強等優點，可重復或連續使用，且易于與產品分離，是食品、醫藥、化工等領域的研究熱點之一[3，4]。依據酶的性質和用途，酶的固定化方法主要可以分為以下4種：吸附法、交聯法、包埋法和共價結合法[5]。

酶的固定化可以使用多種載體，其中海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態多聚糖，它是由β-（1，4）-D-甘露糖醛酸和α-（1，4）-L-古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羥基，可溶于不同溫度的水中，生物相容性好，穩定、無毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材與載體材料，也常被用作固定化酶的載體[6]。聚乙二醇是一種無毒的高分子聚合物，與水有極好的互溶性，它的相對分子質量可從幾千到幾萬，控制其相對分子質量的大小以及用量，可調節海藻酸鈣中孔的尺寸、體積和密度[7]。以聚乙二醇為海藻酸鈉制孔劑，兩者在水溶液中形成均一體系，將兩者混入氯化鈣溶液中時，海藻酸鈉轉化為交聯的網狀大分子，海藻酸鈣形成固態，聚乙二醇可以從固態的海藻酸鈣中溶出，即形成多孔結構的海藻酸鈣。當聚乙二醇相對分子質量為4 000時，海藻酸鈣支架中可形成蓬松均勻的多孔結構，適用于組織工程多孔材料的應用[8]。

本試驗采用海藻酸鈉包埋交聯法制備固定化α-淀粉酶，得到最佳的固定效果，并對游離酶和固定化酶的酶學性質進行了比較。采用聚乙二醇作為制孔劑，為進一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性，提高α-淀粉酶的酶學性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

試驗于2013年5月在武漢工程大學完成。

AL204型電子分析天平（METTLER TOLEDO）；722S型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；81-1型加熱磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；DSHZ-300型多用途水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

試驗中使用的α-淀粉酶購自北京雙旋微生物培養基制品廠；聚乙二醇4 000購自BIOSHARP公司。其余試劑均購自中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。試劑純度均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 淀粉溶液多糖含量標準曲線的繪制 用DNS法標定淀粉溶液中的多糖含量[9]。分別取40、60、80、100、120 μL 2%淀粉溶液（m/V，下同），計算多糖含量，加入1.0 mL稀碘液，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻后在600 nm波長下比色。以吸光度值為縱坐標，對應多糖含量為橫坐標，繪制標準曲線并列出線性回歸方程。

1.2.2 α-淀粉酶的固定化 取4 mL 4%海藻酸鈉溶液（m/V，下同），1 mL 2%羧甲基纖維素鈉（以下簡稱CMC）溶液（m/V，下同），2 mL 2% α-淀粉酶溶液，用蒸餾水定容至10 mL，置于磁力攪拌器上混合均勻，用5 mL注射器吸取上述混合液，以10 cm左右的高度逐滴滴入含有0.4%戊二醛的2%氯化鈣溶液（m/V，下同）中，固定0.5 h后濾出小球，用蒸餾水洗滌2～3次，儲存于4 ℃冰箱中備用[10]。

1.2.3 α-淀粉酶活力的測定 以200 μL 2%淀粉溶液為底物，加入100 μL pH 6.0的1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，400 μL蒸餾水，300 μL適當稀釋的α-淀粉酶溶液，于60 ℃水浴鍋中準確反應15 min，立即加入1.0 mL 0.1 mol/L鹽酸終止反應。從中吸取1.0 mL反應液，加1.0 mL稀碘液，用蒸餾水定容至10.0 mL，混合均勻后在600 nm波長下比色。

固定化酶的活力測定方法是將上述方法中適當稀釋的α-淀粉酶溶液替換為一定量的固定化α-淀粉酶。在60 ℃、pH 6.0的條件下，以每反應15 min消耗1 mg多糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3 數據分析

采用Image-Pro Plus 5軟件分析固定化酶的直徑。

2 結果與分析

2.1 固定化α-淀粉酶的單因素試驗

2.1.1 不同濃度海藻酸鈉對固定化酶活性的影響 分別取濃度為1.6%、2.0%、2.4%、2.8%的海藻酸鈉溶液進行試驗，結果見圖1。由圖1可知，當海藻酸鈉濃度為2.0%時，固定化酶活性最大，當海藻酸鈉濃度繼續增大時，固定化酶活性有所下降，其黏度增大，難以擠壓成球狀，并且所形成的凝膠小球體積過大，影響酶與底物充分結合。

由圖2可知，4種不同濃度海藻酸鈉固定化酶的平均直徑分別為2.61、2.67、2.99、3.02 mm，即當海藻酸鈉濃度逐漸增大時，固定化酶小球的直徑隨之增大。產生這一現象的原因在于當海藻酸鈉濃度增大時，單位體積中能與鈣離子結合的位點數量也相應增加，進而得到直徑較大的固定化酶小球。

2.1.2 不同濃度酶對固定化酶活性及固定效率的影響 分別取濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的酶液進行試驗，結果見圖3。由圖3可知，當α-淀粉酶的濃度由0.2%逐步增加到0.8%時，固定化酶的活性先增高而后趨于穩定，但固定效率卻逐步降低。這主要是因為固定化酶凝膠小球內固定的酶量先逐漸增加而后趨于飽和，過多結合的酶造成酶分子聚集成團，酶分子活性中心可能被部分遮蓋，與底物不能充分接觸，從而影響固定化酶活性與固定效率。

2.1.3 不同濃度氯化鈣對固定化酶活性的影響 分別取濃度為1%、2%、4%、8%的氯化鈣溶液進行試驗，結果見圖4。由圖4可知，固定化酶活性在氯化鈣濃度變化范圍內先增加而后逐漸降低。當氯化鈣濃度為2%時，固定化酶相對活性最高，固定效果最佳。

4種不同濃度氯化鈣制備的固定化酶平均直徑分別為2.74、2.66、2.59、2.52 mm（圖5），即當氯化鈣濃度逐漸增加時，固定化酶的直徑隨之減小。推測可能是海藻酸鈉中的α-（1，4）L-古羅糖醛酸結構與鈣離子交聯形成蛋盒（egg-box）結構，氯化鈣主要影響的是交聯程度，其濃度越高，固定化酶結構的致密程度越高，因此濃度大的氯化鈣會降低固定化酶的活性與直徑。

2.1.4 不同濃度CMC對固定化酶活性的影響 分別取濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的CMC溶液進行試驗，結果見圖6。由圖6可知，當CMC濃度為0.2%時，固定效果最佳。固定化酶活性隨CMC濃度的增加逐漸升高，當CMC濃度超過0.2%時，混合液的黏度增加，固定化酶活性降低。

2.2 固定化α-淀粉酶的正交試驗

正交試驗結果見表2。由表2可知，最佳固定化酶的制備工藝為A1B2C2D1，其中各因素影響大小依次為A、C、B、D。利用最佳組合淀粉酶0.4%，氯化鈣2%，羧甲基纖維素鈉0.2%，海藻酸鈉1.6%進行驗證試驗，得到固定效率可達92.43%。可見，優化后的工藝固定效率較高，穩定可行。

2.3 固定化酶與游離酶的酶學性質比較

2.3.1 pH對固定化酶與游離酶活性的影響 在最佳工藝條件下，取pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測定游離酶與固定化酶的活性，試驗結果見圖7。由圖7可知，游離酶和固定化酶的最適反應pH均為6.0，與游離酶相對活性相比，固定化酶的相對酶活變化幅度不大，即固定化酶在pH變化范圍內能夠保持相對較高的酶活，相比游離酶具有更寬的適應性。

2.3.2 溫度對固定化酶與游離酶活性的影響 在最佳工藝條件下，于45～80 ℃測定游離酶與固定化酶活性，試驗結果見圖8。由圖8可知，游離酶被固定化以后，其最適反應溫度由原來的60 ℃上升至65 ℃，當反應溫度繼續提高時，固定化酶活性明顯高于游離酶，這可能是因為固定化載體提高了酶空間結構對熱的穩定性。

2.3.3 固定化酶與游離酶熱穩定性的比較 將游離酶與固定化酶分別在60、75、90 ℃水浴0.5 h后再測定酶活，以放置在4 ℃冰箱內的游離酶與固定化酶作為對照，試驗結果見圖9。由圖9可知，在高溫條件下，固定化酶活性損失明顯小于游離酶，即使在90 ℃水浴0.5 h，其仍能保持33%左右的相對酶活，而游離酶的相對酶活只剩不到10%。

2.4 不同濃度聚乙二醇對固定化酶活性的影響

分別加入濃度為0.5%、1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%的聚乙二醇4 000制備多孔固定化酶，以不加聚乙二醇的樣品作為對照，試驗結果見圖10。由圖10可知，添加聚乙二醇4 000后，固定化酶活性均高于對照，當添加的聚乙二醇濃度為2.5%時，固定化酶活性最高，比對照提高37.61個百分點，明顯有利于酶促反應的進行。

2.5 游離酶與固定化酶米氏常數的比較

利用Lineweaver-Burk作圖法以1/V對1/[S]作圖，按照直線在橫軸上的截距（-1/Km）求米氏常數Km，結果見圖11。結果表明，不加聚乙二醇固定化酶的Km為6.1 mg/mL，添加聚乙二醇固定化酶的Km為3.7 mg/mL，而游離酶的Km為2.8 mg/mL，即不加聚乙二醇的固定化酶對底物的親和力最小，這與固定化載體的空間障礙與擴散限制有關；添加聚乙二醇后，固定化酶形成的多孔結構有利于提高對底物的親和力，且這2種固定化酶對底物的親和力均小于游離酶。

3 小結

本試驗采用海藻酸鈉包埋交聯法制備固定化α-淀粉酶，探討了最佳的固定化條件，并對游離酶和固定化酶的酶學性質進行了比較，正交試驗的優化組合為海藻酸鈉1.6%，α-淀粉酶0.4%，CMC 0.2%，氯化鈣2%，在此條件下固定效率可達92.43%。在酶學性質方面，固定化酶比游離酶的最適反應溫度高，兩者最適反應pH相同，且固定化酶具有更寬的適應性。在α-淀粉酶的固定化體系中加入濃度為2.5%的聚乙二醇4 000，能使酶活性提高37.61個百分點。

海藻酸鈉包埋交聯法制備的固定化α-淀粉酶具有很好的應用前景，與游離酶相比，這種固定化方法有利于酶與底物的分離，也便于酶的重復或連續使用，更加節約成本，是一種很好的固定化方法。

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