產油酵母菌高產培養基的營養成分優化

摘要：以產油酵母菌Y1為供試菌株，通過單因素及正交試驗對其產脂發酵培養基進行優化。結果表明，最優培養基組成為葡萄糖85 g/L、蛋白胨40 g/L、（NH4）2SO4 10.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.300 g/L、Na2HPO4 3.0 g/L、 KH2PO4 2.5 g/L。按照營養成分最優組合，100 mL三角瓶裝液量30 mL，液體種子接種量10%，搖床轉速160 r/min，溫度28 ℃，得到的產油酵母菌Y1生物量為20.25 g/L，生物量比優化前提高了46.5%。

關鍵詞：產油酵母；營養成分；產脂；發酵；優化

中圖分類號：S963.32+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5832-04

我國人均石化資源貯量十分有限，而能源需求量卻與日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潛在油源。由微生物生產富含多種生理功能的不飽和脂肪酸油脂已引起國內外的廣泛重視。因此，微生物油脂的研究將成為新世紀油脂工業的一個發展方向[1-3]。微生物油脂，又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌和細菌等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內產生的油脂[4]。自然界中一些產油微生物在碳源充足而其他營養成分（通常為氮源）缺乏的情況下，可以在胞內大量積累油脂，甚至達到自身干重的60%以上[5]。產油真菌積累油脂過程中可在胞內形成一個或多個油脂顆粒[5-7]。與傳統油脂生產相比，微生物油脂生產有許多優點，可連續規模化生產，周期短，所需原料豐富、價格便宜，并可利用工農業廢棄物；且不受季節、氣候變化限制，可利用細胞誘變、融合及基因工程等技術改良菌種等[8]。

本研究考察了不同碳源、氮源、營養鹽對產油酵母菌Y1細胞生長的影響，通過單因素及正交試驗進行高產培養基優化研究，為產油酵母產脂發酵生產基本配方提供參照，以期為合理利用廉價原料及大規模發酵生產微生物油脂奠定基礎[9]。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產油酵母菌Y1：包頭師范學院生物科學與技術學院實驗中心保存。試驗于2012年3—4月在包頭師范學院生物科學與技術學院微生物實驗室完成。

1.1.2 培養基和試劑 液體種子培養基：20 g/L葡萄糖、5 g/L （NH4）2SO4、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L MgSO4·7H2O。

基礎發酵產脂培養基：30 g/L葡萄糖、1.5 g/L蛋白胨、2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L （NH4）2SO4。

1.2 方法

1.2.1 發酵產脂培養基最適碳源和氮源 選擇葡萄糖作為發酵產脂培養基的碳源，最適濃度為 85 g/L[10]，后續試驗用此濃度作為葡萄糖基礎濃度。

牛肉膏[10]為發酵產脂培養基的最適氮源，但考慮到牛肉膏成本較高、保存稍有不當極易染菌，所以選取獲得菌體生物量稍低于牛肉膏蛋白胨作為后續試驗的氮源。

1.2.2 產油酵母菌Y1種子液的培養[11] 取活化后斜面產油酵母菌Y1一環，接種于500 mL液體種子培養基中，28 ℃，180 r/min培養14 h，備用。

1.2.3 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基最適氮源濃度測定 將發酵產脂培養基中蛋白胨濃度分別調整為3、5、8、12、17、23、30 g/L，其他成分不變，以10%接種量接入培養14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養，在培養14～32 h之間每隔2 h取樣測定發酵產脂培養液的OD600，然后以蛋白胨濃度為橫坐標，以每個蛋白胨濃度中所測得OD600為縱坐標，繪制曲線圖。

1.2.4 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基的營養鹽最適濃度測定 將發酵產脂培養基中營養鹽濃度分別調整為表1中所示濃度，進行單因素優化試驗，其他成分不變（碳源和氮源分別以所測得最適濃度作為后續試驗的基準濃度），以10%接種量接入已培養14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養，在培養14～32 h期間，每隔2 h取樣測定發酵產脂培養液OD600，然后以不同營養鹽濃度為橫坐標，以在每種營養鹽濃度中所測得的平均OD600為縱坐標，繪制曲線圖[12]。

1.2.5 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基營養成分正交試驗 將單因素試驗中得到的發酵產脂培養基各營養成分最適濃度作為正交試驗各因素濃度水平中間值，建立L25（56）正交試驗[13]。以10%接種量接入已培養14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養，在培養14～32 h期間，每隔2 h取樣測定發酵產脂培養液OD600。

2 結果與分析

2.1 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基最適氮源濃度

氮源可促進細胞生長，在嚴重缺氮的條件下可觀察到細胞內脂類的積累。無機氮有利于不飽和脂肪酸的產生，有機氮有利于細胞增殖[14]。以蛋白胨濃度為橫坐標，以每個蛋白胨濃度的OD600為縱坐標繪制曲線圖，如圖1所示。由圖1可知，在蛋白胨濃度為30 g/L時，OD600達到峰值。說明以葡萄糖作為最適碳源且濃度為85 g/L時，蛋白胨的最適濃度為30 g/L。

2.2 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基最適營養鹽濃度

以發酵產脂培養基不同營養鹽的濃度作為橫坐標，以發酵產脂培養液OD600為縱坐標繪制曲線圖，如圖2～5所示。

在葡萄糖濃度為85 g/L，蛋白胨濃度為30 g/L時，（NH4）2SO4在細胞中可作為氮源的適當補充，并為細胞提供相應的微量元素。由圖2可以看出，在（NH4）2SO4濃度為16 g/L時，OD600達到峰值，說明其最適濃度為16 g/L。

MgSO4·7H2O是酶的激活劑，適量的濃度可以促進菌體生長[15]。由圖3可知，MgSO4·7H2O的最適濃度為0.1 g/L。Na2HPO4、KH2PO4可以維持細胞的滲透壓[15]，由圖4、圖5可知，二者的最適濃度分別為3 g/L和2 g/L。

2.3 產油酵母菌Y1發酵產脂培養基營養成分的正交試驗結果

分別以葡萄糖濃度85 g/L，蛋白胨濃度30 g/L，（NH4）2SO4濃度16 g/L，MgSO4·7H2O濃度0.1 g/L，Na2HPO4濃度3 g/L，KH2PO4濃度2 g/L作為正交試驗中各因素濃度水平中間值，進行正交試驗，各因素和水平見表2。發酵產脂培養液OD600見表3。

由表3可知，各因素影響大小的順序為蛋白胨、MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4、（NH4）2SO4、KH2PO4，其中對產油酵母菌Y1的OD600影響最大的是蛋白胨，MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4對OD600的影響居中且影響力較接近，（NH4）2SO4、KH2PO4對OD600的影響最小。正交試驗得到最優營養成分組合為A4B4C1D5E3F4。

根據產油酵母菌Y1發酵產脂培養基最佳營養成分組合A4B4C1D5E3F4進行驗證試驗，測得培養時間為22 h時，發酵產脂培養基培養液OD600為1.031，優化前培養液OD600為0.761。離心分離并洗滌得到酵母，測得發酵產脂培養基培養的菌體濕重為44.63 g/L，優化前濕重為37.12 g/L。60 ℃烘干至恒重，測得由發酵產脂培養基培養的菌體干重為20.25 g/L，優化前菌體干重為13.82 g/L，比優化前提高了46.5%。由于在同等條件下，菌體干重（生物量）與油脂產量呈正相關，優化后的發酵產脂培養基有助于提供產油酵母菌菌體干重，即可提供菌體油脂產量。

3 小結

產油酵母菌Y1發酵產脂培養基營養成分最優組合為：葡萄糖85 g/L，蛋白胨40 g/L，（NH4）2SO4 10.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.300 g/L，Na2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 2.5 g/L。按照營養成分最優組合，100 mL三角瓶裝液量30 mL，接種量10%，搖床轉速160 r/min，溫度28 ℃，得到的產油酵母菌Y1生物量為20.25 g/L，優化后生物量比優化前提高了46.5%，表明該營養成分優化結果合理、可行，為產油酵母菌的利用提供參考。

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