程序性死亡受體1 與T細胞及其亞群比率的變化對膿毒癥急性肺損傷患者的影響

陳泰裕，曾海文，丁志榮（通信作者）

泉州市第一醫院 （福建泉州 362000）

膿毒癥是一種多因素導致的全身炎癥反應綜合征，其發病率和病死率逐年增加[1-3]。急性肺損傷是膿毒癥患者常見的并發癥，患者常表現為肺水腫、呼吸窘迫等癥狀。目前，膿毒癥誘導的急性肺損傷治療方法較少，且效果欠佳。研究發現，膿毒癥主要由嚴重感染所致的免疫抑制所引發[4-5]。李康等[6]研究發現，膿毒癥患者外周血T 細胞及Treg 細胞表面程序性死亡受體1（Programmed cell death protein 1，PD-1）呈明顯高表達，與膿毒癥病情進展及不良預后密切相關，且T 細胞PD-1 的高表達與膿毒癥的病情嚴重程度和不良預后呈正相關[7-9]。雖然目前T 細胞亞群和PD-1 在膿毒癥患者中的研究較多，但臨床對于膿毒癥急性肺損傷患者的研究較少。因此，本研究旨在探討PD-1 與T 細胞及其亞群比率對膿毒癥肺損傷患者的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月至2022 年1 月我院收治的30 例膿毒癥急性肺損傷患者為研究組，選取同期30 例膿毒癥無急性肺損傷患者為對照組、30 名健康體檢者為空白組。研究組男18 例，女12 例；年齡50～65 歲，平均（58.49±5.51）歲；急性生理學及慢性健康狀況評估系統Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）評分為（18.72±0.89）分。對照組男20 例，女10 例；年齡51～64 歲，平均（57.34±6.18）歲；APACHE Ⅱ評分為（17.62±1.62）分。兩組的年齡、性別、APACHE Ⅱ評分比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。空白組男18 例，女12 例；年齡49～65 歲，平均（56.41±7.35）歲。所有入選者均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會批準（泉一倫[2020]221 號）。膿毒癥診斷符合2016 Sepsis3.0 指南診斷標準[10]，急性肺損傷西醫診斷符合《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南2006》[11]。

納入標準：符合上述診斷標準；存在感染灶擴散疾病；年齡40～70 歲；精神狀況正常。排除標準：患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、風濕性疾病等免疫相關疾病；長期使用免疫抑制性藥物和細胞毒藥物；不能配合檢查，有明顯精神障礙且難以正常交流。

1.2 方法

抽取研究對象空腹靜脈血5 ml，離心取上清液，通過酶聯免疫吸附法測定炎癥因子[腫瘤壞死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin- 6，IL-6）和C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）]水平。按照淋巴細胞亞群分析試劑及單克隆ELISA 試劑盒的具體說明書，于計數管分別滴加TriTEST CD4+、CD8+、CD4+CD25+及PD-1 試劑及抗凝血試劑混勻，黑暗條件下孵育25 min 后滴加溶血劑，再次孵育25 min，然后采用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+、CD4+CD25+Treg 細胞的百分比及細胞表面PD-1 水平。

1.3 評價指標

（1）收集3 組入院第1 天血清TNF-α、IL-6 和CRP 水平。（2）收集3 組第1、3、5、7 天的外周靜脈血，采用流式細胞術分析3 組7 d 內CD4+、CD8+和CD4+CD25+Treg 細胞的比例。（3）比較3 組PD-1 陽性表達情況，并采用序貫器官衰竭評估系統（sequential organ failure assessment，SOFA）評分和APACHE Ⅱ評分評估患者感染和病情嚴重程度，評分與嚴重程度成正比。（4）分析不同細胞亞群PD-1 的表達與SOFA 評分、APACHE Ⅱ評分及預后的相關性。（5）分析比較不同預后的膿毒癥急性肺損傷患者T 細胞亞群細胞表面PD-1 水平。（6）30 例膿毒癥急性肺損傷患者按28 d 預后分為死亡組（8 例）與生存組（22 例），分析膿毒癥急性肺損傷患者CD4+、CD8+和CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 水平預測患者不良預后的價值。

1.4 統計學處理

采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組炎癥指標比較

對照組、研究組IL-6、CRP、TNF-α 水平明顯高于空白組，且研究組高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 3 組炎癥指標比較（±s）

表1 3 組炎癥指標比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；IL-6 為白介素6，CRP 為C 反應蛋白，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α

組別 例數 IL-6（ng/L） CRP（mg/L） TNF-α（ng/L）對照組 30 44.31±1.92a 42.42±11.27a 67.73±13.72a研究組 30 51.62±11.21ab 52.28±11.26ab 88.72±12.73ab空白組 30 22.28±4.28 19.31±9.18 31.21±8.83 F 142.169 76.240 177.988 P<0.001 <0.001 <0.001

2.2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞比例比較

入院后第7 天，對照組、研究組中CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞水平顯著升高，CD4+計數顯著下降；與空白組比較，對照組和研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞計數比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg細胞比例比較（%，±s）

表2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg細胞比例比較（%，±s）

注：與空白組比較，aP<0.05

組別 例數 CD4+ CD8+ CD4+CD25+Treg入院第1 天對照組 30 5.24±1.62 12.19±1.51 8.82±2.11研究組 30 4.31±1.92 12.38±1.85 8.79±2.52空白組 30 6.58±2.51 7.19±1.85 4.79±2.13入院后第3 天對照組 30 5.47±1.12 13.56±1.83 8.91±2.72研究組 30 5.27±1.71 13.71±2.19 8.98±2.34空白組 30 6.43±1.11 7.28±1.37 4.63±1.94入院后第5 天對照組 30 5.19±1.93 12.74±1.54 9.42±2.13研究組 30 4.83±1.65 14.17±2.18 9.78±3.19空白組 30 6.38±1.79 7.83±1.71 4.37±1.93入院后第7 天對照組 30 5.28±1.89a 13.18±2.42a 9.83±2.79a研究組 30 4.37±2.17a 14.32±3.18a 9.18±2.93a空白組 30 6.72±2.16 7.82±1.39 4.17±2.56

2.3 3 組不同細胞表面PD-1 情況與APACHE Ⅱ、SOFA 評分

對照組和研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 的表達水平高于空白組，且研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 的表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。研究組SOFA 評分為（9.05±1.89）分、APACHE Ⅱ評分為（21.12±3.79）分，明顯高于對照組（6.87±1.68）分、（14.03±3.65）分，差異有統計學意義（P<0.05）。

表3 3 組不同細胞表面PD-1 表達情況比較（±s）

表3 3 組不同細胞表面PD-1 表達情況比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；PD-1 為程序性死亡受體1，SOFA 為序貫器官衰竭評估系統，APACHE Ⅱ為急性生理學及慢性健康狀況評估系統Ⅱ

CD4+CD25+PD-1（%）對照組 30 47.72±4.97a 41.72±5.98a 6.87±1.39a研究組 30 58.25±8.08ab 48.38±6.82ab 9.87±2.36ab空白組 30 10.73±2.99 8.82±2.18 3.19±0.86 F 566.672 463.962 122.247 P<0.001 <0.001 <0.001組別 例數 CD4+PD-1（%）CD8+PD-1（%）

2.4 不同細胞表面PD-1 與APACHE Ⅱ及SOFA評分的相關性分析

CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 水平與APACHE Ⅱ、SOFA 評分呈正相關（P<0.05），見表4。

表4 不同細胞表面PD-1 與APACHE Ⅱ及SOFA 評分的相關性分析

2.5 不同預后膿毒癥急性肺損傷患者T 細胞、Treg 細胞表面PD-1 水平比較

死亡組CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1水平高于生存組，差異有統計學意義（P<0.05），見表5。

表5 不同預后細胞表面PD-1 水平比較（%，±s）

表5 不同預后細胞表面PD-1 水平比較（%，±s）

注：PD-1 為程序性死亡受體1

組別 例數 CD4+PD-1 CD8+PD-1 CD4+CD25+PD-1死亡組 8 59.18±10.28 47.81±9.17 9.29±1.89生存組 22 39.62±8.27 31.17±5.91 7.72±1.08 t 5.374 5.865 2.860 P<0.001 <0.001 0.008

2.6 不同細胞表面PD-1 水平預測患者不良預后的價值分析

CD4+PD-1 預測患者不良預后的靈敏度、特異度分別為72.19%、84.61%；CD8+PD-1 預測患者不良預后的靈敏度、特異度分別為84.61%、72.26%；CD4+CD25+PD-1 預測患者不良預后的靈敏度、特異度分別為60.31%、81.43%，見表6。

表6 不同細胞表面PD-1 水平預測患者不良預后的診斷價值

3 討論

膿毒癥急性肺損傷以炎癥反應和免疫功能紊亂為主要特征。目前，臨床對于該病的機制研究主要集中在免疫紊亂機制、炎癥機制、凝血系統機制、氧化應激機制及遺傳機制[12-13]。研究發現，PD-L1/PD-1 是膿毒癥免疫應答重要的調節因子，在膿毒癥免疫抑制中發揮重要作用，被認為是膿毒癥發生、發展過程中潛在的免疫檢查靶點。而PD-1 主要表達于活化T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、抗原提呈細胞等免疫細胞中[14-16]。過表達的PD-1 會抑制T 細胞功能，從而增加膿毒癥患者的病死率[17]。李少洪等[18]研究發現，膿毒癥患者的外周血CD4+PD-1 表達升高，且膿毒癥患者的病情程度與外周血CD4+PD-1 表達呈正相關。外周血CD4+PD-1 表達可作為膿毒癥發生、發展的獨立危險因素之一。鐘堅等[19]研究發現，膿毒癥患者CD4+PD-1、CD8+PD-1 表達均升高，且PD-1 的表達隨APACHE Ⅱ、SOFA 評分的增加而增高，與患者膿毒癥病情程度密切相關。曲冰杰等[20]研究發現，膿毒癥患者CD4+和CD8+比例降低，且隨著病情發展，比例會進一步下降；CD4+和CD8+的PD-1 表達升高，隨著病情發展，PD-1 表達水平進一步上升，可見膿毒癥患者外周血CD4+和CD8+細胞數量變化與膿毒癥的發生發展過程密切相關。而在膿毒癥急性肺損傷的發生、發展中，有研究顯示，膿毒癥小鼠肺中CD4+細胞、單核細胞、巨噬細胞的PD-1 表達增加[21]；且膿毒癥急性肺損傷死亡小鼠的外周血T 細胞PD-1 表達水平比存活小鼠明顯增加，但PD-1 敲除小鼠可降低膿毒癥急性肺損傷的病死率，且能減輕膿毒癥后多器官功能衰竭[22]。由此可見，CD4+和CD8+的PD-1 表達與膿毒癥急性肺損傷的發生、發展也密切相關；但在急性肺損傷患者中，PD-1 與T 細胞及其亞群比率的變化對膿毒癥性肺損傷患者預后的影響還不甚明確。

本研究發現，與空白組比較，膿毒癥肺損傷患者血清中IL-6、CRP、TNF-α 的表達水平顯著升高，考慮是膿毒癥患者炎癥反應明顯，炎癥因子高表達[23-24]。另外，對照組、研究組中CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞的表達水平顯著升高，CD4+計數顯著下降；研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 水平與APACHE Ⅱ、SOFA 評分均高于對照組，且CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 水平均與APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分呈正相關，考慮原因為膿毒癥患者持續性感染、病毒刺激導致機體免疫功能受損，誘導CD4+細胞凋亡，機體釋放大量CD4+CD25+Treg 細胞，影響機體免疫應答，進而造成患者出現免疫缺陷[20]。且CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細胞表面PD-1 水平升高提示PD-1 可能參與膿毒癥病情進展過程。此外，死亡組CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 水平高于生存組；CD4+PD-1 預測患者不良預后的靈敏度、特異度為72.19%、84.61%；CD8+PD-1 的靈敏度、特異度為84.61%、72.26%；CD4+CD25+PD-1的靈敏度、特異度為60.31%、81.43%，提示CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 水平對膿毒癥急性肺損傷患者預后存在一定的預測價值。

綜上所述，膿毒癥急性肺損傷患者CD4+、CD8+、CD4+CD25+Treg 細胞計數顯著改變，CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 表達水平增加且對患者預后存在一定的預測價值。