分離自藏靈菇的乳酸菌的益生特性*

郭志華，楊洪

(宿州學院化學與生命科學學院，安徽 宿州，234000)

藏靈菇是源自西藏藏南的林芝地區和新疆天山天池以上海拔山區的特有珍稀菌種，呈乳白色、膠質狀，外形酷似米粒;經過牛奶培養，個體會慢慢增大，形狀如盛開的雪蓮，故又稱之為西藏雪蓮。藏靈菇發酵奶的風味與普通酸奶有較大的差別，除了具有發酵奶特有的酸味、香味，還有輕微的醇香味［1］。

藏靈菇的發酵液營養豐富，具有醫療和保健作用。經過研究發現藏靈菇發酵液具有提高人體免疫［2］、調節腸胃［3-4］、抑菌［5］、抗氧化［6-7］等功能;并證實藏靈菇主要由乳酸菌和酵母菌組成［8-9］。其中乳酸菌是一種安全、優質的益生菌，在人體內具有抑制病原菌生物生長、維持腸道菌群平衡、調節胃腸功能等益生作用。

本研究主要從藏靈菇中分離純化乳酸菌，研究乳酸菌的益生特性，為食品發酵生產提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

藏靈菇來自于民間。在實驗室將藏靈菇放在10%(W/V)的無菌脫脂牛奶(105℃滅菌20 min)中，置于28℃環境，每隔2 d更換一次牛奶。

1.1.2 培養基

MRS培養基:1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.2%檸檬酸氫二銨，2%葡萄糖，0.1%吐溫80，0.5% 乙酸鈉，0.2%K2HPO4，0.058%MgSO4，0.025%MnSO4，1.8%瓊脂，蒸餾水 100 mL，pH 6.2 ～6.6。

1.1.2 試劑

PCR試劑盒、膠回收試劑盒等購于Invitrogen公司;藥敏試紙購于北京天壇生物技術開發公司;其余均為國產分析純或化學純。

1.1.3 儀器

AL204分析天平;BBS-SDC-A超凈工作臺;MULTISKAN GO酶標儀，美國Thermo;SHP-250型生化培養箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

用接種環取1環藏靈菇發酵乳培養物，在含有1%CaCO3的MRS平板上劃線，37℃培養48 h，滅菌牙簽蘸取有透明圈的單菌落，接入MRS液體培養基中37℃培養48 h，進行接觸酶反應。

1.2.1 乳酸菌的鑒定

1.2.1.1 形態特征觀察

觀察單菌落形狀、顏色、表面等培養特征。進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形狀、排列方式等形態特征。

1.2.1.2 16S rDNA的擴增和序列分析

基因組DNA的提取參照文獻［10］的方法并稍做改進。以細菌16S rDNA通用引物為上下游引物，染色體DNA為模板擴增菌株的16S rDNA。PCR反應條件為:94℃ 3 min;94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 2 min，循環29次;72℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物由生物技術有限公司測序，16SrDNA序列通過Blast進行核酸數據比較。1.2.2 乳酸菌益生特性研究

1.2.2.1 產酸實驗

將分離菌株接種MRS液體培養基(pH 6.4)，置于37℃培養24 h，用pH計測定培養基的pH的變化，同時測滴定酸度。

1.2.2.2 pH對菌株生長的影響

將MRS液體培養基 pH值調為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，分別取各pH的培養基5 mL置于試管中，滅菌備用。將分離的菌株接種于MRS液體培養基中培養24h后，取新鮮菌液按5%(v/v)分別接種于上述各pH的試管中，置于37℃培養24 h后測OD600。

1.2.2.3 溫度對菌株生長的影響

分離出的乳酸菌接種MRS液體培養基中，分別置于30℃、40℃、50℃、60℃水浴 1h，按 5%(v/v)接種于新鮮液體培養基，置于37℃培養24 h，測OD600。

1.2.2.4 耐膽鹽能力測定

用豬膽鹽配制含有0.1%、0.2% 、0.3%、0.4%、0.5% 和0.6%膽鹽濃度的MRS液體培養基，將制備好的菌懸液按5%(v/v)接種到各培養基中，37℃恒溫培養48 h，測OD600。

1.2.2.5 菌株對腸道有害菌群的抑菌性試驗

將活化好的金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)和沙門氏菌(S.enterica)菌液稀釋，取0.1 mL涂布在固體培養基中。將濾紙制成直徑為6 mm的圓形紙片(121℃滅菌30 min)，收集乳酸菌發酵液，將浸染發酵液的紙片分別貼于涂有致病菌的平板上，每個平板貼3個濾紙片，兩兩相距30 mm左右，37℃培養48 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.2.2.6 抗藥性實驗

利用藥物紙片瓊脂擴散法，抗生素濃度分別為:乙酰螺旋霉素2 240 U/mL;青霉素2 000 U/mL;鏈霉素2 000 μg/mL，將益生菌涂布在MRS瓊脂培養基上后，將浸染抗生素的藥片貼于平板上，于37℃培養48 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

所有的實驗數據采用excel軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定

2.1.1 形態觀察與培養特征測定

采用含CaCO3的MRS培養基分離純化出5株乳酸菌，這5株菌革蘭氏染色均為陽性，接觸酶反應為陰性，初步判斷符合乳酸菌特征。顯微鏡觀察，zlg1、zlg3、zlg4均為球菌，球形或卵圓形，無芽孢，成對或短鏈狀;zlg2、zlg5均為桿菌，無芽孢，單個或短鏈狀。

2.1.2 16S rDNA的擴增和序列分析

以菌株的DNA為模板，PCR擴增得到大小為1.5 kb的基因片段。采用Blast與GenBank中已登錄的基因序列進行比對，結果發現zlg1、zlg3、zlg4的16S rDNA與乳酸乳球菌的同源性分別為98%、98%、99%;zlg2、zlg5的16S rDNA與嗜酸乳桿菌的同源性分別為98%、98%。

根據培養特征和16S rDNA比對分析。zlg1、zlg3、zlg4初步鑒定為為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);zlg2、zlg5初步鑒定為嗜酸乳桿菌(Lactcbacillus acidophilus)。取zlg4和zlg2為實驗對象，研究其益生特性。

2.2 zlg4和zlg2益生特性研究

2.2.1 產酸試驗

牛乳發酵過程中，乳糖水解產生乳酸，使牛乳的pH值下降滴定酸度上升。酸度是發酵乳的重要指標之一，與產品的口味、質地和風味有關。圖1表明，zlg2、zlg4在發酵前4 h，菌株生長緩慢，產酸能力較弱，組間組內顯著差異性顯著(P＞0.05)。從4 h到20 h，隨著發酵時間延長，乳酸菌開始大量繁殖，產酸量大幅增加，pH值快速降低，zlg2的產酸量要大于zlg4，組間組內顯著差異(P＜0.05)。20 h后菌體生長開始逐漸衰亡，pH值降幅趨緩。

圖1 乳酸菌發酵過程中pH值和滴定酸度的變化Fig.1 Change in pH value and titratable acidity of lactic acid bacteria during fermentation

2.2.2 pH值對菌株生長的影響

由圖2可知，當pH值為2、3時，兩菌株生長較緩慢;pH值為4時有一定程度的生長;在pH值為5時能夠較好地生長;pH值為6時生長最好。說明這2株菌有較好的耐酸性。

2.2.3 溫度對菌株生長的影響

圖2 pH對菌株生長的影響Fig.2 Effect of pH on growth of lactic acid bacteria

由圖3可看出，2株菌經30℃、40℃水浴處理后生存率最高，組內組間差異不顯著(P＞0.05);50℃水浴處理后的存活率與40℃相比，zlg4和zlg2分別為:88%、71.43%;60℃水浴處理后，zlg4存活率為65%，zlg2為43%。經統計分析，50℃、60℃水浴處理后2株菌存活率存在顯著差異(P＜0.05)，zlg4的溫度耐受性大于zlg2。

圖3 溫度對菌株生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of lactic acid bacteria

2.2.4 耐膽鹽能力測定

由圖4可看出，低濃度膽鹽(0.1%)對2株菌的生長沒有明顯影響，組間組內無顯著差異(P＞0.05);隨著膽鹽濃度的升高，2菌株的存活率逐漸下降，當膽鹽濃度為0.4%和0.5%時，2株菌的存活率降至39%和29%。且從膽鹽濃度為0.2%開始，2株菌之間的存活率存在顯著差異(P＜0.05)，說明這2株菌對膽鹽耐受力不同，zlg2要強于zlg4。

圖4 乳酸菌耐膽鹽性Fig.4 Bile toleranc of lactic acid bactera

2.2.5 2菌株對腸道有害菌群的抑菌性試驗

表1說明2株乳酸菌對3種腸道病菌均有一定抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌抑制效果較明顯。zlg2的抑菌性強與zlg4，統計分析結果顯示存在顯著差異(P＜0.05)。由產酸試驗可知，zlg2產酸性強于zlg4，酸性較強可導致周圍環境pH值下降，降低氧化還原電位，對許多革蘭氏陽性或陰性細菌產生抑制作用［11］。此外，乳酸乳球菌可普遍產生乳酸乳球菌素，對包括食品腐敗菌和致病菌在內的許多革蘭氏陽性菌具有強烈的抑制作用［12］。

表1 乳酸菌抑菌圈直徑 mmTable 1 The bacteriostasia diametere of lactic acid bacteria mm

2.2.6 耐藥性試驗

由圖5可看出2株菌對青霉素、氨芐青霉素、氯霉素較敏感;對慶大霉素、氟哌酸敏感不強。統計分析表明，2株菌的耐藥性存在顯著差異(P＜0.05)。

圖5 乳酸菌耐藥性Fig.5 Resistance to antibiotic resistance of lactic acid bacteria

3 討論

從藏靈菇中篩選出5株乳酸菌，通過形態特征、16SrDNA序列同源性分析，初步鑒定3株菌為乳酸乳球菌，2株菌為嗜酸乳桿菌。

益生菌在到達腸道前先要通過胃，胃中的胃酸可以殺死大部分微生物，開發益生菌首先要考察其對酸的耐受能力。zlg2和zlg4在pH值為2、3時生長較緩慢，pH值為4時可生長。

溫度是影響菌株發酵的重要因素之一，高溫可縮短凝乳時間，2株菌經50℃、60℃水浴處理后仍有一定的存活率，說明兩株菌可耐受高溫。耐膽鹽也是乳酸菌特性之一，2株菌在膽鹽濃度為0.4%和0.5%時，仍有39%和29%的存活率。乳酸菌可產生有機酸、細菌素等抑菌物質，可殺死腸道有害菌群，具有維持腸道菌群平衡功能。

本研究中發現2株菌對常見抗生素如青霉素、氨芐青霉素、氯霉素較敏感，但對慶大霉素和氟哌酸產生耐藥性。FAO/WHO在《用于食品益生菌安全性評價指導原則》中指出，益生菌存在的可能危害包括益生菌菌株產生廣泛的耐藥性，可以使抗藥基因在菌株之間傳播［13］。乳酸菌抗藥性有內源抗藥性和獲得性抗藥性，內源性抗藥性一般不發生抗藥基因的水平轉移;獲得性抗藥性表現出高水平的抗藥性，抗藥基因可在細菌種屬間傳播［14］。目前應用到發酵食品中的乳酸菌基本都是野生型，一般不經過二次消毒即可直接食用，有可能與腸道正常菌群或致病菌進行抗藥因子的傳遞。乳酸菌在作為生產菌株之前，有必要檢測菌株耐藥性，預防抗藥菌株的擴散。

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