Mozzarella 干酪提取液的抗菌活性

彭登峰，柴春祥，馬玲，王偉

1(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300314)

2(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷，030801)

Mozzarella干酪中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和有機(jī)酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高。干酪中的蛋白質(zhì)經(jīng)過發(fā)酵成熟后，由于凝乳酶和發(fā)酵劑微生物產(chǎn)生的蛋白分解酶的作用，形成了多肽等可溶性物質(zhì)［1］。

酪蛋白抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，廣泛存在于生物界，是先天免疫的重要防御物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性［2］。干酪中豐富的酪蛋白是抗菌肽的重要來源，近年來干酪中酪蛋白抗菌肽的抑菌性引起了人們的廣泛關(guān)注和研究。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，已于酪蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抑菌性的抗菌肽［3］。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是由Jones＆Simms(1930)提取的，他們發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)能夠抑制鏈球菌的增長(zhǎng)，把這種物質(zhì)命名為乳抑菌素。之后，另外一個(gè)研究小組也發(fā)現(xiàn)了一種從酪蛋白提取的抗菌肽，這種抗菌肽可能是來自k-酪蛋白和αs1-酪蛋白，并對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用［4］。

目前我國(guó)對(duì)干酪抗菌肽的研究較少，而且對(duì)干酪的綜合利用不高。為此，本試驗(yàn)以不同成熟期的Mozzarella干酪為原料，用3種方法制備干酪的提取液，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉為指示菌，驗(yàn)證提取液的抗菌性。本試驗(yàn)的意義在于驗(yàn)證干酪中提取液的生理功能以及對(duì)微生物的抑制作用，為干酪抗菌肽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)和理論前提。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 原料乳

新鮮牛乳，來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站，密度1.030 g/mL，干物質(zhì)11.05%，蛋白含量3.03%，酪蛋白含量2.27%，將脂肪標(biāo)準(zhǔn)化至3.0%，使C/F(酪蛋白∶脂肪)的比值為0.76。

1.1.2 供試菌種

Streptococcus salivarius subsp.Thermophilus(唾液鏈球菌嗜熱亞種)CH9、Lactobacillus delbrueckil subsp.bulgaricus(保加利亞乳桿菌德氏亞種)LB，來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室。

大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(S.cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)，來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 凝乳酶

Stamix1150，CHR HANSEN 生產(chǎn)，活力為35 000RU/g。

1.1.4 主要試劑

NaOH，冰醋酸，醋酸鈉，蒸餾水，三氯乙酸，來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室。

1.1.5 主要儀器與設(shè)備

自制干酪槽(加工量為2 L)、干酪刀、干酪模具、培養(yǎng)皿、牛津杯、濾紙片(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室提供);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);單式真空包裝機(jī)(溫州市鼎力包裝機(jī)械制造有限公司);DL-CJ-2F醫(yī)療型潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);LC406立式冷藏陳列柜(江蘇阪神電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Mozzarella干酪的制作［5］

參照文獻(xiàn)［5］來制作Mozzarella干酪。

1.2.2 Mozzarella干酪抗菌物質(zhì)的提取

無菌蒸餾水提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置1 h，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL pH值為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

三氯乙酸溶液提取法:稱取Mozzarella干酪30 g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100 mL 12%的三氯乙酸溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

本試驗(yàn)根據(jù)干酪的成熟時(shí)間(40、50、60 d)分3次提取，每次提取時(shí)用上面3種提取方法。

1.2.3 菌種活化［6］

將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基裝入試管后擺斜面，在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行菌種斜面活化。

1.2.4 接種涂布

取無菌培養(yǎng)皿，做標(biāo)記后迅速倒入滅菌后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基20 mL，并快速而輕巧地晃動(dòng)培養(yǎng)皿，平置冷卻備用［7］。

分別在培養(yǎng)皿中用移液槍移取少量的無菌蒸餾水，滴到培養(yǎng)皿的中央，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉，接種時(shí)要將菌融在無菌蒸餾水中，然后用涂布器涂勻。

1.2.5 提取液抗菌活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)(Bulet et al.1991)并做適當(dāng)改進(jìn)，采用濾紙片法(唐裕芳等，2005)和牛津杯法測(cè)定提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑制作用［7-8］。

濾紙片法:用無菌鑷子夾住滅菌后的濾紙片分別在不同的提取液中浸泡一下，在瓶口濾去多余樣液，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記貼到相應(yīng)的位置，貼完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測(cè)量抑菌圈的直徑。

牛津杯法:用無菌鑷子夾住滅菌后的牛津杯放入培養(yǎng)皿相應(yīng)位置，然后用移液槍根據(jù)標(biāo)記移取30 μL的提取液于牛津杯中，移取完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.6 空白的制作

分別量取100 mL的無菌蒸餾水、pH值為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和12%的三氯乙酸溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁的物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記用濾紙片法和牛津杯法測(cè)定3種空白提取液是否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mozzarella干酪提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用

由圖1、圖2可以看出，不同成熟期Mozzarella的干酪，用3種不同提取方法進(jìn)行提取，其提取液對(duì)大腸桿菌都有一定的抑制作用。

無菌蒸餾水提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.75 cm;醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為60 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.95 cm;TCA提取成熟期為50 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.50 cm。

圖1 干酪的提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.1 The antibacterial effect of cheese extract on Escherichia coli

圖2 不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對(duì)大腸桿菌的抗菌性Fig.2 The antibacterial activity of Mozzarella cheese extract during different ripening on Escherichia coli

2.2 Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖3可以看出3種不同提取方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。

圖3 干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用Fig.3 The antibacterial effect of Cheese extract on Bacillus subtilis

無菌蒸餾水提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.71 cm;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.68 cm;用TCA提取的成熟期為60 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為3.51 cm。

2.3 Mozzarella干酪的提取液對(duì)酵母菌的抑制作用

由圖4可以看出3種不同提取方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對(duì)酵母菌都有一定的抑制作用。

圖4 干酪的提取液對(duì)酵母菌的抑制作用Fig.4 The antibacterial effect of cheese exfract on S.cerevisiae

用無菌蒸餾水提取的成熟期為50 d Mozzarella干酪的提取液對(duì)酵母菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.11 cm，在40、60 d時(shí)用無菌蒸餾水制備的提取液對(duì)酵母菌沒有抑制作用;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法提取出Mozzarella干酪成熟40、50 d時(shí)的提取液對(duì)酵母菌的抑菌性差不多，抑菌圈直徑分別為1.30 cm和1.28 cm，Mozzarella干酪成熟60 d時(shí)用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液制備的提取液對(duì)酵母菌的抑菌性相對(duì)較差，抑菌圈直徑為1.20 cm，用TCA提取法提取出Mozzarella干酪成熟60 d時(shí)的提取液對(duì)酵母菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.93 cm。

2.4 Mozzarella干酪的提取液對(duì)黑曲霉的抑制作用

圖5 干酪的提取液對(duì)霉菌的抑制作用Fig.5 The antibacterial effect of cheese extract on Aspergillus niger

由圖5可以看出用無菌蒸餾水提取的Mozzarella干酪成熟40、50、60 d時(shí)的提取液對(duì)黑曲霉沒有抑制作用;用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取的Mozzarella干酪成熟50 d時(shí)的提取液對(duì)黑曲霉的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.06 cm;用TCA提取法提取的Mozzarella干酪成熟60 d時(shí)的提取液對(duì)黑曲霉的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.10 cm。

3 結(jié)論

(1)用無菌蒸餾水提取的Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對(duì)黑曲霉沒有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌抑菌效果較為明顯;醋酸-醋酸鈉緩沖溶液提取法和TCA提取法提取Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用。

(2)用無菌蒸餾水提取法提取出Mozzarella干酪成熟40 d時(shí)的提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌性最強(qiáng)，用TCA提取法提取出Mozzarella干酪成熟60 d時(shí)的提取液對(duì)枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌性最強(qiáng)。用TCA提取法提取Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對(duì)4種菌的抑制作用相對(duì)較好。

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