麥芽糖轉糖基酶產環糊精性質的研究*

劉書磊，黃永忠，黃虹，楊成，王水興

1(南昌大學中德聯合研究院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

2(江西省豐城市荷湖農業綜合服務站，江西豐城，331100)3(江西省農科院，江西南昌，330200)

環糊精是一類由6個及以上D-吡喃葡萄糖單元組成的環狀葡聚糖，作為一類特殊的智能分子，其擁有筒狀的疏水內腔和親水外表，可以與適當形狀和大小的客體分子形成包合物，從而改變客體分子的水溶性、穩定性和揮發性等。目前已廣泛應用于食品、醫藥、化工、輕工以及農業等領域［1-3］。

麥芽糖轉糖基酶(amylomaltase)正是一類可將直鏈淀粉轉化成環糊精的淀粉酶，其作用于直鏈淀粉可以得到聚合度(指D-吡喃葡萄糖單元數)10～50不等的大環糊精(聚合度大于9的環狀糊精及為大環糊精)。麥芽糖轉糖基酶不僅可以催化分子內(環化作用)和分子間(歧化作用)的轉糖基作用，還可以將環糊精的環打開將其偶聯到受體糖上(偶聯作用)，同時還具有水解作用［4-7］?；诖?，不同的環境條件對該酶的不同活性可能表現出不同的影響，從而影響最終環糊精的得率。為此，研究不同環境條件對麥芽糖轉糖基酶合成環糊精的影響，對提高環糊精得率具有一定的意義。

本研究以直鏈淀粉作為底物，通過麥芽糖轉糖基酶催化合成環糊精，主要研究了反應過程中底物濃度、酶濃度、溫度、pH以及小分子有機物對環糊精得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器設備

直鏈淀粉:購自sigma公司。

麥芽糖轉糖基酶:本實驗室構建的基因工程菌所表達［8］。

二甲基亞砜、無水乙醇(均為分析純):天津市永大化學試劑有限公司;麥芽糖:北京鼎國生物技術有限責任公司;3，5-二硝基水楊酸(化學純):國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖測定試劑盒:上海榮盛生物技術有限公司;β-淀粉酶:Novozymes贈送;Tris-HCl緩沖液自制。

752C紫外可見分光光度計:上海第三分析儀器廠;恒溫水浴鍋:德國LAUDA公司T型;pHS-3C型精密pH計:上海雷磁儀器廠;臺式冷凍離心機:sigma公司;電子分析天平:日本AND公司ER-180A型。

1.2 方法

1.2.1 還原糖的測定

標準曲線的繪制:繪制標準曲線采用 GAIL LORENZ MILLER 的方法［9］。

含量測定:根據初始糖的含量吸取相應體積的樣品(最多不超過120 μL，不足者用蒸餾水補充至120 μL)于試管中，再分別加入100 μL蒸餾水和150 μL DNS試劑，搖勻，沸水浴10 min，冷水浴冷卻至室溫后分別用蒸餾水定容至3.5 mL，在波長540 nm處測溶液吸光度，根據標準曲線計算還原糖的量。環化產率計算:

1.2.2 酶活力測定

準確吸取500 μL 10%(w/v)麥芽糖溶液(稱取一定量麥芽糖，溶于Tris-HCl緩沖液)于具塞試管中，加入100 μL酶液，搖勻，35℃反應10 min后立即沸水浴滅活。以預先滅活的酶液為對照組，用葡萄糖氧化酶法測定測定葡萄糖的量［10］。

酶活力單位定義為:在上述條件下每分鐘增加1μmol葡萄糖所需要的酶量為1個活力單位。結果測得本研究中使用的麥芽糖基轉移酶的酶比活力為1U/mL。

1.2.3 不同因素對環化反應轉化率的影響

1.2.3.1 本實驗環糊精的制備方法

取一定量直鏈淀粉溶液(準確稱取50 mg直鏈淀粉加入5 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，溶解后加入5 mL 0.5 mol/L HCl，蒸餾水定容至10 mL，馬上使用)于具塞試管中，加入適量酶液，用Tris-HCl緩沖液定容到1 mL，35℃水浴反應，分別于 30、60、90、120、150 min取樣150μL，立即沸水浴10 min，冷卻后分別加入1 μL β-淀粉酶，50℃反應 5 h，沸水浴 10 min 后，6 000 g ×5 min 離心［11］。

原始組:先將酶液沸水浴10 min滅活后，再按相應比例加入直鏈淀粉溶液和緩沖液，其他操作與實驗組都相同。

對照組:用蒸餾水代替直鏈淀粉溶液，其他操作與實驗組都相同。

1.2.3.2 各種因素對轉化率的影響

參照1.2.3.1節方法，其中加入一定量直鏈淀粉溶液與相應的酶量，Tris-HCl緩沖液為50 mmol pH 7.2。取不同時間的反應液經β-淀粉酶消化后測上清液中還原糖的量，并依據還原糖的量計算環化產率。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對轉化率的影響

終濃度分別為 0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%的淀粉溶液與0.1U的酶反應，底物濃度對轉化率的影響見圖1。

圖1 底物濃度對轉化率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on conversion rate

從圖1可以看出，隨著底物濃度的提高環糊精的轉化率并不是隨之下降的，而是先升高后降低，這是由于當底物濃度過低時，麥芽糖轉糖基酶除了表現環化活性外，更多的表現出了水解活性，生成了相對較多的小分子糖，而環化反應對小分子糖的利用率更低。但底物的濃度過高其轉化率自然會降低。由此可以推斷，底物濃度只有在一定的范圍內，才會有相對較高的轉化率。

2.2 酶量對轉化率的影響

終濃度為0.10%的淀粉溶液與0.05、0.10、0.15、0.20U的酶分別反應，酶量對轉化率的影響見圖2。

圖2 酶量對轉化率的影響Fig.2 Effect of the dosage of enzyme on conversion rate

從圖2可以看出，隨著酶用量的增加環糊精的轉化率在反應的最初一段時間是逐漸增加的，但隨著反應時間的延長高酶量并沒有使得轉化率隨之有明顯的升高，但酶量過低時其轉化率雖然在隨著反應時間的延長不斷增加，但反應150 min時其轉化率仍明顯低于其他組。由此可以推斷，當酶用量增加到一定值時反應體系中環糊精的生成速度與分解速度基本一致，底物的轉化率基本保持恒定。

2.3 pH值對轉化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應，用50 mmol的Tris-HCl緩沖液控制反應體系pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0。pH 值對轉化率的影響見圖3。

圖3 pH值對轉化率的影響Fig.3 Effect of pH on conversion rate

從圖3可以看出，pH 6.5時底物的轉化率最高，說明在該pH值時麥芽糖轉糖基酶的環化活性最高，而pH為5.0和9.0時轉化率明顯降低，說明該酶在這兩個pH值時很不穩定，隨著反應的進行快速失活，此外由于隨著聚合度的增大環糊精在過低的pH值條件下穩定性會降低，這也可能是pH 5.0時轉化率低的一個原因。由此可以推斷該酶的環化最適pH為6.08.0，在環化反應中選擇合適的pH值對轉化率影響很大。

2.4 溫度對轉化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應，反應溫度分別為 20、30、35、40、45、50、60℃。溫度對轉化率的影響見圖4。

圖4 溫度對轉化率的影響Fig.4 Effect of temperature on conversion rate

從圖4可以看出，在40℃條件下底物的轉化率始終是最高的，說明在所選溫度中40℃是環化反應的最適溫度;在20℃和30℃的條件下，150 min時轉化率基本40℃時持平，可見在這兩個溫度下麥芽糖轉糖基酶能在150 min內保持相當高的活性;在60℃條件下，60 min時轉化率增長極其緩慢，說明該酶在60 min之內，其環化活性快速失活。由此可知，選擇合適的反應溫度不僅可以使酶保持較高的活性，更可以使反應快速到達較高的轉化率，進而縮短反應時間。

2.5 有機小分子對轉化率的影響

終濃度為1.0‰的淀粉溶液與0.1U的酶反應，分別加入麥芽糖是其終濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL;無水乙醇使其終濃度為5%、10%;二甲基亞砜使其終濃度為5%、10%。這3種有機小分子對轉化率的影響分別如下圖5、圖6和圖7所示。

從圖5可以看出，麥芽糖的加入使底物的轉化率明顯降低。這是由于麥芽糖的加入增加了轉糖基反應的受體，就使得麥芽糖轉糖基酶的歧化反應和偶聯反應更容易發生，這樣就抑制了環糊精的生成。當加入麥芽糖終濃度為1.0 mg/mL的時候其底物轉化率反而比終濃度為0.5 mg/mL時有所提高，這可能是由于在麥芽糖轉糖基酶的作用下，加入的麥芽糖多次參與反應生成，其中有一部分經環化反應參與了環糊精的合成，但整體表現仍為抑制。由此可以推斷，反應體系中麥芽糖的加入會抑制環糊精的生成。

圖5 麥芽糖對轉化率的影響Fig.5 Effect of maltose on conversion rate

圖6 乙醇對轉化率的影響Fig.6 Effect of ethanol on conversion rate

圖7 二甲基亞砜對轉化率的影響Fig.7 Effect of dimethyl sulfoxide on conversion rate

從圖6可以看出，乙醇的加入使底物的轉化率在30 min時大幅提高至約35%，這是由于乙醇的分子極性較高，當其加入后與反應體系中的聚糖分子通過氫鍵相結合，進而抑制分子間歧化反應的發生，這樣大量的直鏈淀粉只能自身進行環化生成環糊精。但隨著反應的進行麥芽糖轉糖基酶其他的活性使得轉化率又有所下降。另外可能由于高濃度乙醇的存在對底物在溶液中穩定性有一定的影響，而使得添加乙醇至終濃度為10%時反比終濃度為5%時轉化率有所下降，但仍高于未加乙醇時的轉化率。由此可知，乙醇的加入可以提高環糊精的轉化率。

從圖7可以看出，二甲基亞砜的加入使底物的轉化率所表現出的情況與加入乙醇時非常相似，其原因同樣是由于二甲基亞砜的分子極性很高，一定成都上抑制了歧化反應。但與乙醇不同的是當其較高濃度時轉化率也隨之有所提高，這可能是作為“萬能溶劑”二甲基亞砜加強了底物溶液的穩定性所致。由此可推斷，二甲基亞砜可提高環糊精的轉化率。

3 結論

本文研究了底物濃度、酶量、溫度、pH、麥芽糖、乙醇、二甲基亞砜對反應轉化率的影響，表明底物濃度過高和過低都會使轉化率下降，而酶用量對最終轉化率影響不大，最適轉化pH值是6.5，最適轉化溫度是40℃，麥芽糖對環糊精的合成起抑制作用，乙醇和二甲基亞砜能通過抑制麥芽糖轉糖基酶的歧化反應提高轉化率。

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