濃香型白酒釀造相關(guān)酵母發(fā)酵糟醅產(chǎn)己酸乙酯的研究*

王濤，姚韜，李濤，游玲，周瑞平，王松，馮瑞章

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)

2(宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)3(宜賓敘府酒業(yè)有限公司，四川宜賓，644000)

濃香型白酒中含量和比例協(xié)調(diào)、穩(wěn)定的呈香呈味物質(zhì)主要由窖內(nèi)發(fā)酵體系中微生物群落共同代謝產(chǎn)生。盡管受限于分析檢測(cè)手段和風(fēng)味化學(xué)技術(shù)，目前尚無(wú)法充分解析濃香型白酒中復(fù)雜的呈香呈味物質(zhì)，但己酸乙酯已被確定為濃香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)［1］。目前，行業(yè)采用多種方法來(lái)提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯的含量［2-4］，其中利用高產(chǎn)酯化酶的霉菌和酵母強(qiáng)化制曲以及促進(jìn)黃水、酒尾的窖外酯化是主要手段［2，5］。盡管目前已從濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中分離得到了一些具有較強(qiáng)酯化酶活性的菌株［6-7］，但對(duì)于這些菌株產(chǎn)酯化酶或酯化能力的研究均是在脫離發(fā)酵糟醅的情況下開展的，與生產(chǎn)實(shí)際差異較大。

系統(tǒng)地研究濃香型白酒釀造環(huán)境中酵母菌區(qū)系對(duì)發(fā)酵糟醅中己酸乙酯濃度的影響，可以在一定程度上揭示釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系與發(fā)酵糟醅中生物和非生物因子的互作關(guān)系，為探究釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系在濃香型白酒釀造中的作用，進(jìn)而闡明釀造環(huán)境對(duì)濃香型白酒釀造的重要作用，揭示濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理、改進(jìn)生產(chǎn)提供依據(jù);這些菌株也是一類潛在的生物資源，具有潛在的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2008年以來(lái)分離自濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)釀造諸環(huán)節(jié)，通過(guò)菌落和細(xì)胞表觀特征去除了冗余的122株酵母，經(jīng)多次純化保存于發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。其中糟醅62株、窖房38株、曲房16株、窖泥4株、曲藥2株。

1.1.2 培養(yǎng)基和入窖糟醅

培養(yǎng)基:YPD固體和液體培養(yǎng)基。

入窖糧糟:2011年4月采自四川宜賓某知名酒企的多糧濃香型入窖糧糟(“跑窖法”工藝，添加了20%曲粉)。

1.1.3 主要儀器及試劑

PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品;菌株DNA提取、26S rDNA D1/D2區(qū)片段擴(kuò)增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)產(chǎn)品;其余試劑除己酸乙酯標(biāo)樣為色譜純外，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌活化

YPD培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)后，無(wú)菌水調(diào)整濃度為108個(gè)/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種與發(fā)酵

在釀造車間內(nèi)將入窖糧糟和原窖黃水裝入無(wú)菌500 mL三角瓶中(每瓶400 g糟醅和10 mL黃水)，再接種酵母菌懸液10 mL(每個(gè)處理設(shè)1個(gè)重復(fù);不接種酵母菌懸液為空白對(duì)照)，橡膠塞及保鮮膜封口后遮光發(fā)酵75 d(發(fā)酵時(shí)間為4月～6月)，室內(nèi)溫度采用空調(diào)控制在28℃，同批次入窖糧糟正常入窖發(fā)酵(75 d)的中下層糟醅多點(diǎn)(距窖壁及窖底不同距離)取樣，等重量混合作為窖內(nèi)對(duì)照。

1.2.3 發(fā)酵糟醅中己酸乙酯檢測(cè)

每個(gè)三角瓶取糟醅200 g，窖內(nèi)對(duì)照取樣1 000 g，按照體積比為1∶1加入蒸餾水蒸餾，取餾分100 mL，0.22 μm細(xì)菌濾膜過(guò)濾后進(jìn)行 GC-MS檢測(cè)(島津GCMS-QP2010PLUS)，測(cè)定各樣品中己酸乙酯和乙醇濃度(以1.698 7 g/L的己酸乙酯溶液對(duì)餾分中己酸乙酯濃度進(jìn)行確認(rèn))。其中，窖內(nèi)對(duì)照糟醅窖內(nèi)多點(diǎn)取樣混合;三角瓶中糟醅混勻后再取樣，每個(gè)處理單獨(dú)檢測(cè)后取平均值。

色譜條件:色譜柱為L(zhǎng)ZP-930(30 m×0.32 mm×1.00 μm)毛細(xì)管柱，載氣為高純氦氣，柱溫50℃(保持3 min)，以5℃/min的速率升溫至150℃(保持5 min);以5℃/min的速率升溫至190℃(保持5 min)，以3℃/min的速率升溫至220℃(保持10 min);進(jìn)樣口溫度220℃，進(jìn)樣量0.2 μL，分流比30∶1。

質(zhì)譜條件:電離源EI，電子能量70 eV;離子源溫度200℃，檢測(cè)溫度240℃，溶劑延遲3 min，掃描范圍30～550 amu，倍增電壓1.2 kV。

1.2.4 促進(jìn)糟醅高產(chǎn)己酸乙酯菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)能夠促進(jìn)糟醅中己酸乙酯含量高于窖內(nèi)對(duì)照的酵母開展形態(tài)、生理生化鑒定［8］。并根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］獲得菌株的26S rDNA D1/D2片段，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)完成測(cè)序并獲得GenBank序列號(hào)(具體見(jiàn)文中“圖1”)，序列已上傳至測(cè)得序列經(jīng)校正后在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行比對(duì)，采用Kimura-2［11］計(jì)算相似值，并用BioEdit 5.0.9進(jìn)行檢驗(yàn);采用Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建、編輯與保存。

1.2.5 促進(jìn)糟醅高產(chǎn)己酸乙酯菌株的耐受性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［12］分別檢測(cè)菌株的7%、10%乙醇(V/V)，pH 3.0、3.5 和35℃、38℃條件下的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 糟醅發(fā)酵情況

三角瓶中的糟醅發(fā)酵結(jié)束時(shí)呈潤(rùn)濕、均一的泥黃色，整體發(fā)酵情況良好，發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)霉菌污染情況。經(jīng)發(fā)酵過(guò)程監(jiān)控和出窖后原酒檢測(cè)，窖內(nèi)發(fā)酵糟醅發(fā)酵正常。

2.2 各個(gè)糟醅樣品中己酸乙酯含量

經(jīng)GC-MS檢測(cè)，空白對(duì)照和窖內(nèi)對(duì)照己酸乙酯的濃度分別為0.13 g/L和2.46 g/L;乙醇濃度分別為55.21 g/L和54.28 g/L，其中窖內(nèi)對(duì)照中己酸乙酯和乙醇濃度與采樣企業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況基本一致，也表明本研究中所采用的入窖糧糟及窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程正常。空白對(duì)照中己酸乙酯濃度遠(yuǎn)低于窖內(nèi)對(duì)照，顯示窖池(窖泥)對(duì)于濃香型白酒原酒中己酸乙酯的生成具有重要作用。

接種了酵母的糟醅的己酸乙酯濃度遠(yuǎn)高于空白對(duì)照，達(dá)到了0.78 g/L。超過(guò)50%的供試菌株(73株，占59.84%)可以促進(jìn)發(fā)酵糟醅中己酸乙酯高于空白對(duì)照，其中還有8株酵母高于窖內(nèi)對(duì)照。接種了Z8Y-13(分離自窖房空氣)的糟醅中己酸乙酯濃度達(dá)到了7.50 g/L，分別為空白對(duì)照和窖內(nèi)對(duì)照高57.69倍和3.05倍，在所有樣品中最高;而接種了Z4Y-31菌株(分離自糟醅)的糟醅最低(0.03 g/L)，僅分別為空白對(duì)照和窖內(nèi)對(duì)照的23.08%和1.22%。這表明釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系對(duì)糟醅中己酸乙酯生成具有重要作用;除超過(guò)半數(shù)的菌株可以促進(jìn)己酸乙酯生成外，也有相當(dāng)數(shù)量的酵母菌株可能會(huì)抑制己酸乙酯生成或降解(利用)己酸乙酯。這也在一定程度上體現(xiàn)了自然接種的固態(tài)發(fā)酵體系這個(gè)“黑箱”(Black box)［13］中微生物之間、微生物與環(huán)境因子之間復(fù)雜的互作關(guān)系。

2.3 不同分離來(lái)源的酵母促進(jìn)(抑制)糟醅產(chǎn)己酸乙酯的情況

從不同釀造環(huán)節(jié)分離得到的酵母對(duì)應(yīng)糟醅中己酸乙酯和乙醇濃度如表1。

表1 不同釀造環(huán)節(jié)的酵母促進(jìn)(抑制)糟醅產(chǎn)己酸乙酯的情況Table 1 The statue of the yeasts in promoting(inhibit)caproic acid ethyl ester generating isolated from different brewing stage

從表1可以看出，各樣點(diǎn)酵母對(duì)應(yīng)糟醅中乙醇平均濃度均與窖內(nèi)和空白對(duì)照接近，表明這些樣品發(fā)酵總體正常。能促進(jìn)糟醅產(chǎn)己酸乙酯的73株酵母分離自濃香型白酒釀造的各個(gè)環(huán)節(jié)。其中糟醅(33株)、窖房空氣(23株)、曲房空氣(12株)、窖泥(3株)和曲藥(2株)，分別占各樣點(diǎn)酵母數(shù)的 53.22%、60.53%、75.00%、75.00%和100.00%。這表明在濃香型白酒釀造各個(gè)環(huán)節(jié)均存在能夠促進(jìn)糟醅產(chǎn)己酸乙酯的酵母菌。

從能夠促進(jìn)己酸乙酯濃度增加的酵母的絕對(duì)數(shù)量看，發(fā)酵糟醅的最多，曲藥最少;但從這些菌株在各自樣點(diǎn)供試菌株中所占比例來(lái)看，情況剛好相反。這不僅從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了大曲對(duì)于濃香型白酒生產(chǎn)的重要性及制曲過(guò)程是對(duì)曲藥中功能酵母的定向選擇過(guò)程，還在一定程度上顯示了濃香型白發(fā)酵糟醅中微生物功能的協(xié)調(diào)性(糟醅中抑制或降解己酸乙酯的菌株的相對(duì)數(shù)量和絕對(duì)數(shù)量均為最高)。

不同樣點(diǎn)的酵母所對(duì)應(yīng)的糟醅中己酸乙酯平均濃度分別為:窖房空氣0.97 g/L，窖泥0.75 g/L，糟醅0.73 g/L，曲房空氣0.57 g/L，曲藥0.36 g/L。從己酸乙酯平均濃度和能夠顯著提高己酸乙酯含量(高于窖內(nèi)對(duì)照)的酵母數(shù)量來(lái)看，分離自曲房空氣和曲藥的酵母明顯低于另3個(gè)樣點(diǎn);這在一定程度上顯示窖房生產(chǎn)環(huán)境中(窖房空氣、窖泥、糟醅)的酵母區(qū)系促進(jìn)糟醅中己酸乙酯含量增加的能力更強(qiáng)。

此外，無(wú)論從能夠大幅度促進(jìn)糟醅中己酸乙酯含量的菌株數(shù)量還是對(duì)應(yīng)糟醅中己酸乙酯濃度，窖房空氣都要顯著高于曲房空氣，這表明窖房空氣中的酵母菌區(qū)系促進(jìn)糟醅產(chǎn)生己酸乙酯能力要高于曲房空氣。這為濃香型白酒行業(yè)中關(guān)于“長(zhǎng)期的發(fā)酵生產(chǎn)對(duì)環(huán)境中的微生物區(qū)系進(jìn)行了定向選擇”的推論提供了一定的理論依據(jù)。

2.4 8株酵母的鑒定及其對(duì)釀造環(huán)境的適應(yīng)性

使糟醅中己酸乙酯濃度高于窖內(nèi)對(duì)照的8株菌基于26S rDNA D1/D2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析如表2和圖1，對(duì)乙醇、高酸和溫度的耐受如表3。

表2 8株酵母的同源性分析Table 2 Homology analysis of 8 yeast strains

圖1 基于26S rDNA D1/D2序列繪制的8株酵母的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Dendrogram tree of the 8 yeast strains based on D1/D2 sequences

從表2可以看出，8株酵母中有3株對(duì)應(yīng)的糟醅 中己酸乙酯濃度略高于窖內(nèi)對(duì)照，但有3株比窖內(nèi)對(duì)照高出近1倍。同時(shí)，從8株酵母糟醅中乙醇濃度來(lái)看，發(fā)酵均正常。

按目前酵母菌的分類標(biāo)準(zhǔn)［14-15］，菌株D1/D2區(qū)序列相似性在99%以上且有形態(tài)特征支持時(shí)，可歸為一個(gè)種。結(jié)合表2、圖1和菌株形態(tài)、生理生化特征(結(jié)果略)，8株酵母分屬于Zygosaccharomyces bailii(1株)、Trichosporon coremiiforme(1株)、Issatchenkia orientalis(2株)、Debaryomyces hansenii(4株)等4種。

表3 8株酵母對(duì)乙醇、高酸和溫度的耐受Table 3 Tolerance of 8 yeast strains to alcohol，acid and temperature

通常情況下，窖內(nèi)的主發(fā)酵結(jié)束后乙醇濃度在4.0% ～8.0%(31.58～63.14 g/L)，pH值下降至約3.2，最高溫度在35℃［16-18］。122株酵母中促進(jìn)己酸乙酯生成有5株能夠在含有7%(V/V)濃度及以上的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中的2株還能夠在10%(V/V)的條件下生長(zhǎng);有7株菌能夠耐受pH值為3.0的生長(zhǎng)環(huán)境;7株菌能在35℃的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，其中4株能夠在38℃的條件下生長(zhǎng)。這表明這些菌株很可能能夠在窖內(nèi)發(fā)酵的后期生存并發(fā)揮作用，同時(shí)也顯示這些菌株中的大部分具有在窖內(nèi)(外)應(yīng)用的潛力。

3 討論

本研究結(jié)果顯示濃香型白酒釀造相關(guān)酵母對(duì)于己酸乙酯生成具有重要作用。超過(guò)一半的酵母可以促進(jìn)發(fā)酵糟醅產(chǎn)生乙酸乙酯，而且這些酵母來(lái)自濃香型白酒釀造的各個(gè)環(huán)節(jié);發(fā)酵車間酵母區(qū)系促進(jìn)糟醅己酸乙酯生產(chǎn)能力明顯強(qiáng)于制曲車間;分屬于4個(gè)種的8株酵母，能夠使窖外發(fā)酵的糟醅中的己酸乙酯高于窖內(nèi)發(fā)酵糟醅，且這些菌株大多數(shù)能夠耐受窖內(nèi)的高酸、高醇環(huán)境，具有生產(chǎn)應(yīng)用前景。

目前已發(fā)現(xiàn)酵母酯類化合物的生物合成途徑存在酯化反應(yīng)(脂肪酶/酯酶)、醇解反應(yīng)(醇酰基轉(zhuǎn)移酶)和脫氫反應(yīng)(醇脫氫酶)等3種途徑［19］。由于對(duì)濃香型白酒釀造體系中酵母產(chǎn)己酸乙酯的機(jī)理研究開展極少，目前還普遍認(rèn)為其依賴需要過(guò)量乙醇和己酸的“乙醇與乙酸結(jié)合而成丁酸，再由丁酸結(jié)合乙醇而成為己酸，再經(jīng)過(guò)酯化生成己酸乙酯［1］”途徑。本研究中，三角瓶發(fā)酵體系中雖然也具備了高產(chǎn)乙醇和己酸的條件(發(fā)酵糟醅為添加了曲粉的入窖糧糟;添加了少量原窖黃水以接種部分產(chǎn)己酸窖泥微生物)，而且確實(shí)也能夠高產(chǎn)乙醇。但己酸乙酯比窖內(nèi)對(duì)照高出近2倍的糟醅樣品中的乙醇濃度濃度卻僅略高于窖內(nèi)對(duì)照(見(jiàn)表3)，這顯示濃香型白酒發(fā)酵體系中很可能存在除酯化反應(yīng)以外己酸乙酯生成途徑。

此外，3個(gè)樣點(diǎn)的酵母、8株己酸乙酯高產(chǎn)酵母中的6株所對(duì)應(yīng)糟醅中的乙醇濃度均大于窖內(nèi)對(duì)照;3株酵母糟醅中乙醇濃度大于7%(濃度換算成體積分?jǐn)?shù))卻不能耐受YPD培養(yǎng)基中7%乙醇濃度。這些不僅顯示濃香型白酒釀造環(huán)境中存在大量能夠促進(jìn)發(fā)酵糟醅產(chǎn)生乙醇的酵母，還表明發(fā)酵糟醅中微生物存在密切的協(xié)同作用，而這些與我們?cè)瓉?lái)的相關(guān)研究結(jié)果是一致的［20］。

相對(duì)于以往研究而言，以添加了大曲的入窖糧糟為培養(yǎng)基，并通過(guò)加入對(duì)照窖池原窖黃水的形式接種了部分窖泥微生物，使本研究盡可能地模擬了窖內(nèi)發(fā)酵，結(jié)果更加接近生產(chǎn)實(shí)際，但緣于濃香型白酒發(fā)酵體系的復(fù)雜性和體積、溫度等發(fā)酵參數(shù)的差異，三角瓶和窖內(nèi)2個(gè)發(fā)酵體系還是存在較大的差異。本研究雖然在一定程度上證實(shí)酵母對(duì)于己酸乙酯和乙醇的生成具有重要作用，但也顯示了濃香型白酒發(fā)酵體系的復(fù)雜性，有待于長(zhǎng)期、系統(tǒng)的研究。

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