常壓室溫等離子體快速誘變篩選高脯氨酸產率突變株*

鄭明英，蔡友華，陸最青，嚴杰能，張雪，張翀，李和平，邢新會

1(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶，526060)

2(清華大學化工系，北京，100084)3(清華大學工程物理系，北京，100084)

L-脯氨酸又稱L-吡咯烷-2-羧酸，是氨基酸發酵工業中的重要產品之一。它廣泛應用于合成治療高血壓和心肌衰竭的新藥，如巰甲丙脯酸、苯丁酯丙脯酸。作為復方氨酸輸液原料之一，L-脯氨酸在營養不良、蛋白質缺乏癥、嚴重腸胃道疾患、燙傷及外科手術后的蛋白質補充等方面具有廣泛應用［1-3］。由于L-脯氨酸具有一定的甜度，食品工業上亦可作為食品添加劑使用。

由清華大學自主研發的新型常壓室溫等離子體(ARTP)微生物基因組快速突變技術具有射流溫度低(室溫范圍)，產生的等離子體均勻，無需真空裝置，操作簡易，成本低等優點，ARTP的主要成分是活性離子，其與生物大分子和細胞作用效果明顯，產生突變的多樣性大［4-7］。一系列研究表明，ARTP技術可以快速有效地突變細菌、微藻、真菌、酵母等微生物［8-10］，已成為獲得高得率菌株的有效方法。本文以L-脯氨酸生產菌株(嗜醋酸棒桿菌)為出發菌株，建立了ARTP育種新技術快速突變和高通量篩選脯氨酸高產菌株的方法，篩選到16株與野生菌在生長特性和脯氨酸產率有區別的菌株，并對其中1株高產菌株D3進行了發酵性能的研究，為進一步提高L-脯氨酸產業化水平提供了依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

脯氨酸標準品，星湖生物科技股份有限公司提供。葡萄糖、酵母抽提物，OXOID，England;CaCo3，國藥集團化學試劑有限公司。

搖床(SKY-2102)，超凈臺(HDL哈東聯)，離心機(KUBOTA5922，日本制造)，金屬浴(HB-100)，酶標儀(TECAN infinite M200 PRO)，ARTP育種機(北京思清源生物科技有限公司，北京)。

1.2 菌種和培養基

菌種:谷氨酸生產菌嗜醋酸棒桿菌拉丁名ATCC13870，由廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司提供。

種子培養基(g/L):葡萄糖20，酵母膏3，尿素2，玉米漿粉10，NaCl 3，用NaOH調 pH 至8.0，121℃滅菌15 min。

發酵培養基(g/L):葡萄糖70，玉米漿15，味精50，(NH4)2SO455，KH2PO41，MgSO40.5，硫胺素 100 μg/L，CaCO330，用NaOH調pH至7.2。葡萄糖分消118℃滅菌15 min。其余成分于121℃滅菌15 min。

1.3 ARTP誘變方法

電源功率為115 W，工作氣流量為10 L/min，等離子體發射源與樣品之間距離為2 mm，樣品量為10 μL(培養6 h的菌液)，此條件下誘變的突變效率最高［10］。氦氣作為工作氣體，分別考察照射時間為1、2、3、4、5、6、7、8 和9 min 時的細菌致死率。對處理過的樣品在適當的稀釋度下涂板，通過菌落數來計算致死率，并獲得致死曲線:

其中，U為不經過誘變處理對照菌的總菌落數;T為經誘變處理后對應的總菌落數。

1.4 高通量篩選模型建立

為了快速篩選到高脯氨酸產率的菌株，本實驗室置備了智能的移液工作站以及標準化的孔板離心機，結合深孔的48孔板，建立了高通量篩選模型，其工作 流程如圖1所示。

圖1 ARTP誘變及其高通量篩選流程圖Fig.1 Schematic diagram of the ARTP mutation and high throughput screening

1.5 分析方法

1.5.1 細胞生物量測定

吸取0.1 mL發酵液，用0.1 mol/L HCl稀釋100倍，在650 nm波長下測量吸光度。

1.5.2 脯氨酸含量的測定

采用茚三酮顯色法測定脯氨酸含量［11］。吸取發酵液，適當稀釋，稀釋液濃度控制在0.005～0.050 mg/mL。取稀釋液40 μL于EP管中，然后分別加入40 μL茚三酮溶液和40 μL冰醋酸，在金屬浴中100℃顯色1 h，冷卻至室溫后加入80 μL冰醋酸，使體積為200 μL，用酶標儀于515 nm波長處測定A515nm值。制作茚三酮標準曲線求得公式，通過公式計算出含量后，再乘以稀釋倍數×1/10即得發酵液的脯氨酸濃度。

1.5.3 突變株遺傳穩定性分析

為了分析突變菌的遺傳穩定性，在固體板上活化菌，轉移到液體進行一級培養，連續轉移10次，然后分析比較突變株產脯氨酸能力的遺傳穩定性。

2 分析與結果

2.1 ARTP致死率曲線的測定

按照方法1.3對脯氨酸生產菌的ARTP致死率曲線進行了測定，如圖2所示。

由圖2可知，ARTP對脯氨酸生產菌具有較強的致死能力，按方法1.5.3對菌體的致死率進行了計算，照射2 min后其致死率達到了98.7%，為提高獲得高脯氨酸生產能力和生存能力較強菌株的幾率，本研究把致死率控制在99%以上，在后續的研究中誘變時間定為4 min。

2.2 突變菌株的篩選

取10 μL生長6 h(OD值為1.2～1.8)處于對數生長期的種子液，點滴在誘變載片進行ARTP誘變4 min后，載片放入已裝500 μL種子培養基的離心管，搖勻，分別稀釋10-2和10-3，取100 μL稀釋液涂板，30oC培養36～48 h后，對應10-2和10-3的平板分別平均長出22～28個和12～18個單菌落，按上述步驟平行共做了10塊載片，根據生長菌落的圓整和豐滿度，隨機挑取144個單菌落到48孔板進行高脯氨酸產率菌株的初篩，結果表明，144個菌株較野生菌都有不同程度的提高，其中16個菌株產酸能力與野生菌的比較如圖3所示。

圖3 野生菌和16個突變株培養48 h的脯氨酸產量Fig.3 The proline production of 16 mutants andwild type after 48h fermentation

由圖3可知，其中W0為野生菌，在16個突變株中，C2，D2和D3的脯氨酸生產能力，相比較與野生菌，脯氨酸產量分別提高了 15.74%、15.46%和16.57%。而其它突變株則只略有提高，由此在后續的復篩實驗中，繼續考察C2，D2和D3與野生菌產脯氨酸的情況。

2.3 突變株發酵特性的研究

初篩結果與野生菌相比較，在孔板中的產酸情況，C2、D2和D3表現出較好的性能，通過搖瓶實驗來進行復篩，進一步考察其脯氨酸生產性能，結果如表1所示。

表1 3個突變株搖瓶發酵復篩結果Table 1 Proline production and cell growth of three mutants in the second screening step using flask culture

由表1可知，相比較與野生菌，在搖瓶發酵結果中，突變株C2，D2和D3同樣表現出較好的脯氨酸生產性能，并且其生長趨勢、產酸趨勢與深孔板表現完全一致。由此，在后續的篩選實驗中，可以根據初篩結果，初步確定哪一株菌株的發酵性能情況，以備后續的小試和中試驗證。在3株突變株中，48 h內的發酵情況D3表現出更快的生長速度和更高的產酸性能。與野生菌W0相比，突變株D3在發酵48 h的脯氨酸濃度提高了20.29%，在5%水平上具有顯著性差別。在后續實驗中選擇D3繼續開展其生長特性與遺傳穩定性研究。

2.4 突變株D3生長特性的研究

為更好掌握突變株D3的脯氨酸發酵特性，本節實驗以種子培養基為培養基，對其生長曲線、pH和溫度范圍與野生菌進行比較，結果如圖4、圖5和圖6所示。

由圖4可知，野生菌與D3突變株的生長趨勢基本一致，都表現出延滯期較短，能迅速進入對數生長期，D3突變株的生長速率則略快于野生菌。對其pH范圍研究表明，如圖5所示野生菌和D3突變株在pH范圍為5～11時均能生長。由圖6可知，野生菌與D3對溫度都非常敏感，其最適的溫度為30.5℃。

2.5 突變株D3遺傳穩定性考察

按照方法1.5.4，對D3突變株的生長及脯氨酸生產的遺傳穩定性進行了考察，如圖7所示。

圖4 野生菌與D3突變株生長曲線的比較Fig.4 The typical growth curves of wild strain and mutant D3

圖5 野生菌與D3突變株在不同pH條件下的的生長情況Fig.5 The growth performance of wild strain and mutant D3 at different pH

圖6 野生菌與D3突變株生長溫度范圍的比較Fig.6 The growth performance of wild strain and mutant D3 at different temperatures

圖7 突變株D3的遺傳穩定性分析Fig.7 The analysis of genetic stability for mutant D3

由圖7可知，D3連續傳代10次，分別發酵培養48 h，其OD值都在38.12左右，而脯氨酸濃度則都在6.41～6.69。以上結果表明，D3突變株具有較好的遺傳穩定性。

3 結論

本文構建了ARTP快速誘變和高通量篩選獲得脯氨酸生產菌突變株的方法，得到以下結論:

(1)按方法1.3，經ARTP誘變，照射4 min菌株致死率達到99%以上，表明ARTP對脯氨酸生產菌具有較高的致死效應。在該誘變條件下，按方法1.4 ARTP誘變后的高通量篩選方法，篩選獲得16株脯氨酸生產能力比原始菌有不同程度提高的突變株。其中，3株突變菌株的脯氨酸生產能力提升最為明顯，進一步經搖瓶發酵復篩，培養48 h后，D3表現出較好的生長速率和更高的脯氨酸濃度，其OD650值和脯氨酸濃度分別為38.04和6.58(g/100 mL)，與野生菌相比較，分別提高了9.84%和20.29%。

(2)對D3的生長曲線、pH和溫度范圍與野生菌進行了比較，結果表明，野生菌和D3具有類似的生長趨勢、最適的pH和溫度范圍，但是D3表現出更快的生長速度，低pH下的耐受性較好。

(3)按方法1.6對D3連續傳代10次，每一代培養48h時的OD650值與脯氨酸產量基本沒有變化，表明經ARTP誘變后突變株遺傳穩定性高。

48深孔板和搖床的初步培養結果表明，經ARTP誘變后的菌種無論在生長速率還是脯氨酸濃度，都是有變化的，今后需要進一步開展以下兩方面的工作:對D3菌進行基因組測序，并與野生菌基因組序列進行比較分析，研究突變株的突變機理;在50～100 L發酵罐上進行發酵試驗，進一步驗證D3突變株的脯氨酸生產水平，并對其脯氨酸得率和發酵過程進行分析，為中試和生產提供工程數據。

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