不同包裝方式對半硬質干酪成熟期間蛋白質降解的影響*

馬鳳燕，盧士玲，李開雄

(石河子大學食品學院，新疆石河子，832000)

干酪是一種具有較高營養價值的食品，它含有豐富的蛋白質、脂肪及全部的必需氨基酸、維生素和礦物質等營養成分，蛋白質和脂肪的含量相當于原料乳含量的10倍左右［1］。因此，干酪被營養學家奉為理想的食品，譽之為“奶黃金”，乳業皇冠上的“珍珠”。干酪經成熟發酵過程后，其蛋白質在凝乳酶和發酵劑的作用下分解成胨、肽、氨基酸等可溶性物質，極易被人體消化吸收，消化率可達到96% ～98%［2］。

目前對干酪成熟過程的研究主要集中在蛋白質降解方面，許多研究表明［3-4］，干酪中蛋白質降解產物對干酪質量有重要的影響。干酪的成熟期是一個微生物、生物化學及物理化學協同作用的過程，這些因素共同促進了干酪質構、風味及香味的形成及發展，其中主要的變化是蛋白質降解為小分子的肽和游離氨基酸，從而賦予干酪良好的風味、質地和口感［5］。因而，研究干酪成熟過程中蛋白質的降解可以間接評價干酪的品質［6-7］。

本研究采用真空包裝和涂蠟包裝，2種包裝方法對半硬質干酪進行包裝，對其成熟過程中蛋白質降解進行分析測定，以研究不同包裝方式對半硬質干酪成熟期間蛋白降解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

原料乳:新鮮牛乳。

凝乳酶:小牛皺胃酶，丹麥科漢森公司生產;發酵劑:瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌復合菌種，石河子大學食品學院微生物實驗室提供。

1.2 主要試劑

pH 4.6醋酸鹽緩沖液，12%三氯乙酸，2%茚三酮溶液，pH 8.04磷酸鹽緩沖液，CaCO3，EDTA，鉬酸銨，Na2SO3溶液，對苯二酚，30%丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris，10%SDS，10% 過硫酸銨，TEMED，5%巰基乙醇，0.1%溴酚藍，0.1%考馬斯亮藍均為分析純。

17種混合氨基酸標準溶液，甲醇，乙腈，四氫呋喃，三乙胺(均為色譜純)。

1.3 主要儀器設備

內蒙古三環干酪加工設備;德國KBF系列恒溫恒濕培養箱;萬用電爐;電子天平;電熱恒溫干燥箱;快速恒溫數顯水箱;微量凱氏定氮裝置;UV759紫外可見分光光度計;德國Eppendorf 15R臺式高速冷凍離心機;HI8424NEW便攜式防水型pH測定儀;美國TMS-2000物性分析儀;高效液相色譜儀。

1.4 測定內容及方法

半硬質干酪加工工藝流程［8］:

1.4.1 pH 4.6 可溶性氮測定［9］

準確稱取一定量的干酪，加入pH值為4.6的醋酸鹽緩沖液，將干酪充分磨碎，將懸浮液離心后，取上清液定量地移入凱氏消化瓶，進行凱氏微量定氮，并以占干酪總氮量的百分數表示。

1.4.2 12% 三氯乙酸可溶性氮的測定［10］

準確稱取一定量的干酪，加入質量分數為12%的TCA溶液，將干酪充分磨碎后，將懸浮液離心后，取上清液定量地移入凱氏消化瓶，進行凱氏微量定氮，并以占干酪總氮量的百分數表示。

1.4.3 游離氨基酸總量的測定［11］

1.4.3.1 標準曲線的繪制

準確吸取200 μg/mL的氨基酸標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL(相當于 0、100、200、300、400、500、600 μg 氨基酸)，分別置于比色管中，加水補充至容積為4.0 mL，然后加入茚三酮和磷酸緩沖液各1 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，加水至標線搖勻，靜置15 min后，在570 nm波長下，測定各溶液的吸光度，繪制標準曲線。

1.4.3.2 干酪游離氨基酸含量測定

準確稱取磨碎干酪樣品1 g，置于燒杯中，加入50 mL蒸餾水和2 g左右的活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40 mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。

吸取澄清的樣品溶液2 mL，按標準曲線制作步驟，測定吸光度值，并扣除樣液空白值后，在標準曲線上查出對應的氨基酸微克數。氨基酸含量計算:

式中:c，從標準曲線上查得的氨基酸的含量(μg);m，測定的樣品溶液相當于樣品的質量(g)。

1.4.4 干酪中游離氨基酸含量的測定

樣品處理:干酪與去離子水1∶2混合，勻漿后50℃水浴保溫40 min，然后在4℃下9 000×g離心30 min，去除上層脂肪和下層沉淀，中層清液通過玻璃絨過濾后得到水溶性提取物。取250 μL樣液，100 μL(2 mol/L)KHCO3，200 μL 4 g/L 丹酰氯丙酮，置于80～90℃水浴下 40 min，取出后加入 200 μL 1 mol/L HCl終止反應，冷卻，高速離心12 000 r/min，10 min。取上清液進樣測定。

流動相A:2.72 g乙酸鈉，180 μL三乙胺溶解于1 L超純水中，再用1%冰醋酸調解pH值為7.20，再加3.0 mL混合，用0.22 um水系膜過濾。脫氣處理后于4℃下避光保存。

流動相B:2.72 g乙酸鈉加水至200 mL，用1%冰醋酸調解pH值為7.20，加400 mL乙腈，400 mL甲醇混合，脫氣備用。

17種氨基酸標準溶液:復合氨基酸標準溶液，用0.01HCl稀釋成不同濃度梯度。

色譜條件:色譜柱為 C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，柱溫 40℃。進樣量:20 μL。

1.4.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

樣品處理:取一定量干酪，加10 mL pH 4.6醋酸鹽緩沖溶液，研磨均勻，然后在 4℃，轉速為6 000 r/min的條件下，離心20 min。然后去上清液，將沉淀于-18℃凍干保存。

試驗操作:將配制好的丙烯酰胺溶液迅速灌注在兩玻璃板的間隙中;再在膠液面上小心注入一層水，以阻止氣體進入凝膠溶液。分離膠聚合完全后，到出水層，再用濾紙吸干上層殘余的水;在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，然后立即插入干凈的梳子;樣品是按1∶1體積比加入樣品處理液，100℃加熱5 min使蛋白質變性;濃縮膠聚合完全后，移出梳子，把凝膠固定于電泳裝置上，上下各加入電極緩沖液，按順序加樣，加樣量通常為5 μL;上樣后，采用電壓為60 V，進入分離膠后電壓為80 V;電泳結束后，固定1 h，然后用考馬斯亮藍染色液染色1 h，最后脫色直到背景清晰，一般為3～10 h。

2 結果與分析

分別取真空包裝干酪和涂蠟包裝干酪在成熟0、15、30、45、60、75、90d 的干酪樣品進行測定。使用SPSS18.0進行方差分析，使用Origin7.5作圖。

2.1 干酪成熟過程中pH 4.6的可溶性氮(pH 4.6-SN)含量的變化

pH 4.6-SN的含量，可反應蛋白質水解的程度，它是干酪成熟程度的一種標志。pH 4.6-SN主要分離出的是小肽和中肽，且pH 4.6-SN主要是由凝乳酶的作用產生的［12］。圖1反映了2種包裝的干酪成熟期間pH 4.6-SN含量的變化。

圖1 干酪成熟期間pH 4.6可溶性氮的變化Fig.1 The change of the amounts of the soluble nitrogen of pH 4.6 of cheese during ripening

由圖1可以看出，2種包裝的干酪pH 4.6-SN含量都隨成熟時間的延長而增加。在成熟前15 d內，2種干酪的pH 4.6-SN含量上升緩慢。在成熟45～90 d內2種干酪的pH 4.6-SN含量有很顯的增加，說明這期間，乳酸菌對蛋白質酶解很活躍。經方差分析，隨著成熟時間的延長，2種干酪pH 4.6-SN均顯著增加(P＜0.05)。涂蠟包裝的干酪的pH 4.6-SN含量高于同一時期真空包裝的干酪，差別顯著(P＜0.05)。說明涂蠟包裝的干酪水解程度比真空包裝的水解度高，可能是因為不同包裝方式對蛋白酶解能力的影響不同。

2.2 干酪成熟過程中12%三氯乙酸可溶性氮(12%TCA-SN)含量的變化

圖2為干酪成熟過程中12%TCA-SN含量的變化情況:2種包裝的干酪中12%TCA-SN含量都隨著成熟時間的延長逐漸增加。成熟前期其含量增加平緩，后期快速上升。12%TCA-SN主要是加入的凝乳酶和發酵劑產生的酶共同作用產生的，在成熟前期，主要是凝乳酶酶活性的作用。在成熟后期，一些多肽和中肽在大部分乳酸菌的死亡釋放出的胞內蛋白酶和凝乳酶釋放的肽酶共同作用下迅速水解成小肽和氨基酸，所以12%TCA-SN迅速上升。在成熟過程中，經方差分析，涂蠟包裝干酪與真空包裝干酪12%TCA-SN含量差異顯著(P＜0.05)。

圖2 干酪成熟期間12%TCA可溶性氮的變化Fig.2 The change of the amounts of the soluble nitrogen of 12%TCA of cheese during ripening

2.3 干酪成熟過程中游離氨基酸總量的變化

干酪在成熟期間，酪蛋白分子降解為多肽，多肽降解為游離氨基酸，這些降解產物對于干酪風味形成非常重要［13］，圖3為干酪成熟過程中游離氨基酸總量的變化情況。2種包裝的干酪中游離氨基酸總量都隨著成熟時間的增加而增加，干酪成熟前期游離氨基酸增加速度較慢，成熟期30～60 d游離氨基酸含量直線上升，說明這一階段蛋白質水解程度劇烈。成熟初期，乳酸菌細胞裂解的少，細菌酶含量較低，所以游離氨基酸總量增加較慢;隨著乳酸菌細胞的裂解增加，細菌酶量也在逐步增加，所以游離氨基酸產量增加。經方差分析，在整個成熟過程中，涂蠟包裝干酪產生游離氨基酸的量都高于真空包裝干酪降解產生游離氨基酸的量。在成熟后期較顯著(P＜0.05)。

圖3 干酪成熟期間游離氨基酸總量的變化Fig.3 The change of the amounts of free amino acids of cheese during ripening

2.4 干酪成熟過程中氨基酸種類的變化

真空包裝干酪成熟期間氨基酸的變化情況列于表1。由表1可知，真空包裝的干酪在成熟15 d時，丙氨酸，脯氨酸未檢測到。隨著成熟時間的延長，氨基酸的種類也在增多。干酪在成熟45 d時17種氨基酸全部檢測出，并且各種氨基酸的含量較以前也發生了很大的變化。

總體來看大部分的氨基酸含量在增加，部分氨基酸如天冬氨酸前期增加，到后期減小。谷氨酸，脯氨酸，異亮氨酸前期增加，中期減小，后期增加。其中纈氨酸的含量最大，其次是亮氨酸，脯氨酸，酪氨酸。含量較小的是天冬氨酸，組氨酸，精氨酸，丙氨酸。成熟90 d時，干酪包含了人體所需的8種必需氨基酸。

涂蠟包裝干酪成熟期間氨基酸的變化情況列于表2。由表2可知，涂蠟包裝的干酪在成熟期15 d時17種氨基酸全部檢測出，包含了人體所需的8種必需氨基酸，并且都發生了不同程度的增減。大部分氨基酸變化規律同真空包裝，但同一成熟時期2種包裝的干酪中同種氨基酸含量不同，涂蠟包裝干酪中組氨酸和丙氨酸含量都顯著(P＜0.05)高于同時期真空包裝干酪中的含量。在涂蠟包裝干酪中變化較大是纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸，分別增加了163.76，57.9，51.2 mg/100 g。

表1 真空包裝(Z)干酪成熟期間氨基酸的變化Table 1 The change of the amounts of free amino acids of Z cheese during ripening

表2 涂蠟包裝(T)干酪成熟期間氨基酸的變化Table 2 The change of the amounts of free amino acids of T cheese during ripening

從氨基酸在不同成熟期變化規律看，并不是所有的氨基酸都隨成熟期的延長一直增加，一些氨基酸在成熟中期有所下降，后期又增加。這說明干酪成熟期間游離氨基酸處于動態平衡狀態，原因可能是乳酸菌產生的脫氨酶、脫羧酶、轉氨酶及一些轉氨基酸側鏈的酶將所產生的氨基酸轉化為胺、2-酮酸和其他氨基酸，或者是游離氨基酸做為乳酸菌的生長物質被利用［13］。

2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

酪蛋白的降解是干酪成熟過程中的重要生化反應，利用SDS-PAGE電泳，可以考察干酪在成熟期內酪蛋白的降解情況。它能根據蛋白片段和肽片段分子質量大小將其分成不同的條帶;條帶顏色的深淺反應出其含量的多少。2種包裝的干酪在不同成熟期的SDS-PAGE電泳圖，如圖4所示。

圖4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.4 The electrophoresis figure of SDS-PAGE

從圖4可以看出Zone1和Zone2是凝膠中主要的電泳帶。Zone1主要包含了 β-酪蛋白(β-CN)，Zone2主要包含了α-酪蛋白(α-CN)，Zone3主要包含副κ-酪蛋白。隨著成熟時間的延長，酪蛋白降解，生成小分子的肽類，因此電泳的條帶逐漸增多。由上圖可見，2種包裝的干酪在成熟90 d內，酪蛋白發生了很大的變化。15 d時，zone1，zone2，zone3區形成大而寬的條帶，顏色較重。說明此階段蛋白酶水解活性較小，蛋白質發生了輕微的降解，在成熟初期蛋白質主要以大片段的多肽形式存在。在成熟期45～60 d時，蛋白質發生明顯降解，zone1區形成大小不同的條帶，zone2區的大片段也有降解，說明這個階段乳酸菌及凝乳酶釋放出的肽酶主要水解大分子多肽形成小肽片段。成熟期90 d時，Zone1，Zone2，Zone3區都發生了強烈水解，出現了很多小片段條帶，說明這個階段多肽進一步深度水解形成小分子的肽類。隨著成熟時間的延長，小分子條帶也逐漸增多。但涂蠟包裝的干酪在每個成熟階段出現的小片段條帶都較真空包裝的多，尤其是在成熟期75～90 d時較為明顯，說明涂蠟包裝的干酪蛋白降解程度比真空包裝的大。

3 結論

(1)2種包裝的干酪pH 4.6-SN含量和12%TCA-SN含量都隨成熟時間的延長而增加，整個成熟過程中干酪的pH 4.6-SN含量比12%TCA-SN含量增加得快。涂蠟包裝的干酪pH 4.6-SN含量和12%TCA-SN含量顯著 (P＜0.05)高于同一時期真空包裝的干酪，說明涂蠟包裝的干酪水解程度比真空包裝的水解度高，可能是因為不同包裝方式對蛋白酶解能力的影響不同。

(2)2種包裝的干酪中游離氨基酸總量隨成熟時間的延長而逐漸增加，游離氨基酸的種類也在增多。涂蠟包裝干酪產生游離氨基酸的量顯著(P＜0.05)高于真空包裝干酪降解產生游離氨基酸的量。2種干酪在成熟過程中，各種氨基酸含量變化的顯著性不同。

(3)SDS-PAGE圖譜反映2種干酪在成熟期內蛋白質都發生了明顯的降解，成熟末期出現了很多小片段條帶;涂蠟包裝的干酪在每個成熟階段出現的小片段條帶都較真空包裝的多，尤其是在成熟期45～90 d時較為明顯。

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