腸道病毒71型特異性單克隆抗體的制備及其在病毒鑒定中的應用

吳菲菲，董敏，葛路遙，胡馨云，張程，張建華，江炳福，孟繼鴻

(東南大學醫學院，江蘇南京 210009)

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，主要感染5歲以下嬰幼兒，其典型臨床癥狀為發熱和手、足、口腔等部位皮疹或皰疹，少數可出現無菌性腦膜炎、腦炎和心肌炎等嚴重并發癥，個別重癥患兒病情惡化甚至死亡［1-3］。根據2009～2012年衛生部公布的傳染病疫情報告顯示，我國HFMD的發病人數一直高居報告傳染病的首位，疫情逐年上升。近年來，HFMD流行在東南亞地區也有上升趨勢，且EV71和柯薩奇病毒A16(CA16)交替出現［4-7］。嵇紅等人報道了2008年至2010年江蘇省HFMD流行病學研究結果，認為輕癥病例以EV71和CA16共同主導流行，而重癥病例和死亡病例則以EV71感染為主［8］。EV71感染引起的HFMD在臨床癥狀和體征方面與CA16等其它腸道病毒所致的手足口病較難區別，因此需要特異的病原學診斷幫助鑒別。此外，EV71 HFMD的預防和控制需要依靠疫苗，因此從臨床標本中分離、培養和鑒定EV71病毒株用于疫苗株的篩選十分重要。本課題擬制備EV71的特異性單克隆抗體，在此基礎上嘗試建立EV71特異性檢測的免疫熒光技術，用于病毒分離培養后的EV71鑒定，為EV71 HFMD的診斷和疫苗株的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株

本實驗室以往分離鑒定的腸道病毒毒株EV71-NJ05-2010(基因序列號 JQ409487)、CA16-MAS04-2010(基因序列號JQ409496)和Echo6-NJ01-2010(基因序列號JQ409486)［9］于-80℃保存備用。

1.2 單抗的制備

采用常規方法，以EV71 VP1為免疫原免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠，末次免疫后3 d無菌操作取其免疫脾細胞，在PEG4000作用下與骨髓瘤細胞SP2/0以10∶1的比例融合，加入已鋪有飼養細胞的96孔板，用含20%胎牛血清的HAT培養液，置37℃、5%CO2培養箱中選擇培養，用間接ELISA方法篩選。

1.3 單抗的ELISA鑒定

分別用4種代表性腸道病毒VP1蛋白(EV71 HIS-VP1、EV71 GST-VP1、CA16 HIS-VP1 和 Echo6 HIS-VP1)包被酶標板，4℃過夜，PBST洗2遍后加入雜交瘤細胞的培養上清，經37℃孵育40 min、PBST洗5遍后加入1∶10 000 HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，再經37℃孵育40 min、PBST洗5遍后加入底物TMB顯色，采用酶標儀測定A450值。

1.4 標本采集與病毒分離

HFMD患兒的咽拭子標本104份，由南京市兒童醫院、馬鞍山市疾病預防與控制中心和長春市兒童醫院提供。按照《手足口病預防控制指南(2009版)》中樣品采集及檢測技術方案的要求進行預處理，接種非洲綠猴腎細胞(Vero)，置于36℃、5%CO2培養箱連續培養7 d，盲傳3代，若出現人腸道病毒特征性的細胞病變效應(CPE)，則將培養物反復凍融3次，于-80℃保存備用。

1.5 分離病毒的免疫熒光鑒定

將已接種病毒的長成單層的Vero細胞傾去維持液，PBS洗3次后用-20℃預冷的甲醇置于-20℃固定5 min，PBS洗3次后每孔加5%FBSPBS100μl，封閉2 h，吸干，每孔滴加單抗50μl，37℃濕盒中作用1 h，PBS洗3次后每孔加入一定稀釋度的FITC標記羊抗小鼠IgG，37℃濕盒中避光作用1 h，PBS洗3次后吸干，鏡檢，拍照。

1.6 病毒RNA提取及RT-PCR鑒定

參照文獻［10］進行，具體方法如下:取病毒分離上清100 μl，用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒 RNA，操作步驟按照說明書進行。采用OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN)進行擴增，腸道病毒通用引物(Fa、Rb)和 EV71特異性引物(F1、R1)，見表1。一步法RT-PCR的反應體系為20μl，包括:RNA 5 μl，5 × RT-PCR Buffer 4 μl，dNTP Mix(10 mmol·L-1)0.8 μl，Enzyme Mix 0.8 μl，上下游引物(10 pmol·μl-1)各 0.5 μl，水(RNase-free)8.4 μl。一步法 RTPCR的擴增條件為:42℃逆轉錄45 min;95℃預變性15 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，50個循環;72℃末次延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

表1 RT-PCR擴增用引物及其序列Tab 1 Primers for PT-PCR amplification and their sequence

2 結 果

2.1 單克隆抗體的制備與鑒定

共獲得2株穩定分泌McAbs的雜交瘤細胞株，命名為3E12和5C1。用ELISA檢測，這2株單抗均可與EV71 HIS-VP1和EV71 GST-VP1蛋白反應，都不與Echo6 HIS-VP1蛋白反應;3E12不與CA16 HIS-VP1蛋白反應，而5C1則與CA16 HIS-VP1蛋白反應(表2)。結果表明3E12為 EV71特異性單抗，5C1為EV71和CA16的共同性單抗。

表2 抗EV71 HIS-VP1單抗與4種不同蛋白的免疫反應結果Tab 2 Immune reaction results of 3E12 and 5C1 with four kinds proteins

2.2 EV71特異性單抗免疫熒光檢測方法的建立

將制備獲得的單抗3E12和5C1與用3種腸道病毒代表株EV71-NJ05-2010、CA16-MAS04-2010和Echo6-NJ01-2010感染的Vero細胞進行免疫熒光檢測(圖1)，結果3E12只與EV71感染的細胞反應，與CA16和Echo6感染的細胞不反應;而5C1與EV71、CA16感染的細胞反應，與Echo6感染的細胞不反應。由此可見，EV71特異性單抗3E12免疫熒光檢測腸道病毒具有較好的EV71特異性，可以進一步用于EV71的鑒定。

圖1 EV71 HIS-VP1單抗與EV71、CA16和Echo6感染細胞的免疫熒光反應性Fig 1 Immune reaction results of EV71 HIS-VP1 with cells carrying EV71，CA16 and Echo6

2.3 HFMD臨床標本的病毒分離培養

將104份來自不同地區的臨床HFMD患者標本接種Vero細胞，其中有35份分離到病毒，產生腸道病毒典型的CPE，如圖2。

圖2 HFMD標本接種Vero細胞產生的細胞病變Fig 2 Cytopathic effect of Vero cells inoculated by HFMD samples

2.4 分離病毒的免疫熒光鑒定

用EV71特異性單抗3E12免疫熒光檢測從臨床標本分離的35份毒株，其中29份免疫熒光檢測為陽性(EV71)，6份免疫熒光檢測為陰性(非 EV71)，EV71陽性率為82.9%。圖3顯示了部分分離株的免疫熒光陽性與陰性的檢測結果。其中標本1、2、3、4和6免疫熒光檢測鑒定為EV71，標本5免疫熒光檢測鑒定為非EV71。

2.5 分離病毒的RT-PCR驗證

將從臨床標本中分離到的35份毒株抽提病毒RNA，采用EV和EV71單管二重一步法RT-PCR進行病毒驗證(圖4)。35株病毒分離物均能擴增出大小為306 bp的產物，屬于腸道病毒。其中29份均可擴增出大小為889 bp的EV71特異性引物擴增條帶，鑒定為EV71;6份無EV71特異性引物擴增條帶，為非EV71腸道病毒。RT-PCR檢測結果與免疫熒光結果完全一致。

3 討 論

HFMD是常見的出疹性疾病，主要感染兒童。近年來，HFMD在東南亞地區疫情嚴重，反復暴發流行。我國自2008年在安徽阜陽市暴發HFMD以來，該病在我國一直呈高流行態勢。HFMD可由多種腸道病毒引起，EV71是最主要的病原體。自1969年EV71首次分離確認以來［11］，EV71已在全球范圍內引起多次暴發和流行。劉鳳仁等報道了近4年深圳市HFMD流行病學研究結果，認為EV71是引起HFMD的主要病原體。同時也有報道顯示，HFMD重癥病例主要由EV71感染引起。汪照國等［12］報道2008～2009年青島市HFMD流行病學和病原學研究結果，EV71感染引起的HFMD輕癥和重癥的比率均高于CA16。繆梓萍等［13］報道2010～2011年浙江省HFMD病原學特征分析，研究發現重癥病例和死亡病例中EV71核酸陽性的比例分別為85.53%和96.08%。EV71感染引起的HFMD易引發并發癥，從臨床標本中分離、培養、鑒定EV71以進一步研究其生物學特性，對EV71 HFMD的診斷和預防控制具有重要意義。

本研究中我們以EV71 VP1為免疫原制備單抗，共獲得2株穩定分泌的單抗3E12和5C1。2株單抗經ELISA和免疫熒光鑒定，3E12為EV71特異性單抗，5C1為EV71和CA16共同性單抗。以特異性單抗3E12建立的特異性檢測EV71的免疫熒光方法鑒定從不同地區HFMD患者標本中分離的35份病毒株，29份鑒定為EV71，陽性率為82.9%，6份為非EV71的其他腸道病毒。鑒定結果與RT-PCR驗證結果完全一致，表明以特異性單抗3E12建立的免疫熒光方法敏感性高、特異性強。

圖3 單抗3E12免疫熒光鑒定從臨床標本分離的EV71毒株Fig 3 EV71 viruses which were tested by immunofluorescence from clinic samples

圖4 EV和EV71單管二重一步法RT-PCR鑒定臨床標本分離毒株Fig 4 Separated clinic viruses(EV and EV71)identified by RT-PCR

本研究中我們先將標本接種細胞進行病毒分離培養，再利用免疫熒光鑒定分離培養出的病毒。病毒分離培養雖然耗時，對于臨床標本的診斷應用有一定的局限性，但最終可以獲得特定的病毒，對于疾病的診斷來說有最直接的證據，對于確定診斷意義重大，該方法更有利于進一步開展病原學的研究，特別是對疫苗研制提供了眾多的候選株。目前RT-PCR常用于對病毒標本的檢測和鑒定，雖然高度敏感和特異，PCR產物還可以用于基因測序，進一步開展序列分析，但RTPCR技術要求高、操作復雜，且容易污染。實時熒光RT-PCR采用單管閉合及特異性標記的探針來實時監控擴增產物，擴增后不打開管蓋直接通過管內熒光強度進行定量，在檢測時間和檢測靈敏度上均有了明顯的提高，但由于儀器的購置費用較高，較難在基層單位中推廣。總之，無論何種PCR技術最終均不能獲得活的病毒，無法替代傳統的病毒分離培養。本研究通過制備EV71特異性單克隆抗體，建立特異性免疫熒光方法對從HFMD臨床標本中分離培養的病毒進行EV71鑒定，獲得了大量的EV71病毒株，為下一步開展EV71滅活疫苗和減毒活疫苗的研究奠定了基礎。

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