日本蟾蜍聚集素cDNA的克隆與序列分析

袁進強 徐躍 楊仙玉 諸葛慧 張姝芳

（浙江農林大學林業與生物技術學院，臨安 311300）

聚集素（clusterin，CLU）也稱載脂蛋白J，前列腺抑制性睪酮信號-2或硫酸化糖蛋白-2，因其具有聚集細胞的功能而被命名為聚集素［1］。它在人體所有組織中都有表達［2］，參與細胞聚集［1］、脂質運輸［3］、細胞凋亡［4］、蛋白清理［5］和補體調節［6］等多種生理過程。在人類多種惡性腫瘤中clu基因表達上調，并且與腫瘤發生和轉移有密切聯系［2］。因此，成為近年來腫瘤治療的新靶點之一［7-9］。

鑒于蟾酥、蟾衣、蟾皮等中藥材廣泛應用于臨床抗腫瘤治療［10-12］，本研究室開展以日本蟾蜍（Bufo japonicus formosus）皮膚cDNA質粒文庫為模板，通過菌落PCR篩選具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的全長cDNA的工作。本研究篩選到日本蟾蜍clu全長cDNA序列，并運用多種軟件對其編碼的蛋白質進行生物信息學分析，構建系統進化樹，旨在為進一步研究日本蟾蜍CLU蛋白生物學功能及其藥物研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

日本蟾蜍皮膚cDNA質粒文庫通過材料轉讓協議。日本產業技術總合研究所（AIST，Tsukuba，Japan）授權浙江農林大學使用（作者楊仙玉在日本AIST博士后工作期間制備）。該文庫使用的載體為pSD64TR，上下游克隆位點分別為EcoR I和Xho I，載體上、下游引物為SP6（5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3'）和S.D.A.（5'-TTATGTAGCTTAGAGACTC-3'），cDNA的長度介于500-2 000 bp之間。

大腸埃希菌（E.coli）感受態細胞DH5α、PCR反應試劑盒、2×PCR Master Mix等購自天根生化科技有限公司，DNA Ladder、質粒小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術研究所。引物合成與DNA測序委托上海生工生物技術有限公司或上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本蟾蜍皮膚 cDNA質粒文庫轉化 將cDNA質粒文庫0.2 μL電擊轉化到E. coli DH5α感受態細胞中（40 μL），然后迅速加入37℃預熱的160 μL LB培養液，37℃恒溫振蕩復蘇45 min，取2 μL轉化液均勻涂布于LB平板（含Amp 100 μg/mL），并在37℃恒溫培養12-15 h。

1.2.2 全長cDNA篩選 從平板上隨機挑取單菌落接種于10 μL的LB液體培養基中，以此菌液為模板實施菌落PCR。使用的引物是載體上游引物SP6和自行設計的含ploy（T）的cDNA下游引物（5'-AGATCTCTCGAGTTTTTTTTTTTT-3'）。反應體系如下：菌液0.5 μL，2×PCR Master Mix 5 μL，SP6和ploy（T）引物（2 pmol/μL）各1 μL，補加滅菌超純水至10 μL，在反應體系中補加礦物油10 μL。反應條件為：94℃ 5 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 120 s，30循環； 72℃8 min，4℃保存。PCR結束后，取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將擴增出介于500-2 000 bp之間的PCR產物的菌落確定為陽性。

1.2.3 質粒回收、DNA測序與序列分析 將通過菌落PCR確定為陽性克隆的菌液0.2 μL接種于3.5 mL LB培養液中（含Amp 100 μg/mL），37℃恒溫振蕩培養12-15 h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I 雙酶切鑒定，進一步確定陽性克隆及質粒濃度。首先委托公司將陽性克隆質粒使用載體上游引物（SP6）對cDNA進行正向測序。測序結果利用DNAstar查找cDNA的開放閱讀框（open reading frame，ORF），推導氨基酸序列，對具有合理開放閱讀框的克隆繼續委托公司使用載體下游引物（S.D.A.）進行反向測序。

1.2.4 序列分析 利用DNAstar尋找ORF，推導其編碼蛋白的氨基酸序列并分析其理化性質，運用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測其結構功能域，運用CBS的SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽，運用CBS的NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測Asn-X-Ser/Thr糖基化位點，運用METAL DETECTOR V2.0（http：//cassandra.dsi.unifi.it/）預測二硫鍵位點，運用NPS的GOR4（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預測二級結構，運用ExPASy的COIL（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）預測卷曲螺旋結構，運用ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件進行同源性分析，構建系統進化樹。

2 結果

2.1 cDNA的篩選

將日本蟾蜍皮膚cDNA質粒文庫轉化E.coli感受態細胞DH5α獲得的菌落，以SP6和ploy（T）為引物，實施菌落PCR。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，有一菌落PCR產物大小在1 600 bp左右（圖1-A）。將此菌液進行擴大培養、質粒回收及其EcoR I和 Xho I雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示該質粒含有1 600 bp左右的cDNA（圖1-B）。將此質粒委托DNA測序公司進行了正、反雙向測序。

2.2 序列分析

2.2.1測序結果分析及其編碼蛋白的理化性質 對測序結果校對并分析確定已克隆的cDNA其全長1 616 bp，具有1 332 bp的完整ORF、5'端30 bp和3'端254 bp的非編碼區（untranslated region，UTR），編碼由443個氨基酸殘基組成的蛋白質。根據推導的氨基酸序列在GenBank blast同源性分析表明，與其他物種的聚集素具有同源性，故將該cDNA克隆定為日本蟾蜍clu全長cDNA（圖2）（GenBank登錄號為JX035891）。日本蟾蜍clu的ORF推導的氨基酸序列中，正電荷氨基酸殘基（K，R）為55個，負電荷氨基酸殘基（D，E）為69個，疏水性氨基酸（A，I，L，F，W，V）為141個，極性氨基酸殘基（N、C、Q、S、Y）為123個，分子量約為50.627 kD，pI理論值為5.13。

2.2.2 結構預測 SMART預測日本蟾蜍CLU蛋白由兩條多肽鏈組成，這兩條多肽鏈分別與構成聚集素的Cla、Clb家族同源；SignalP4.0預測該前體蛋白含有20個氨基酸殘基的信號肽（圖2），信號肽裂解位點在20和21氨基酸殘基之間，故推測克隆的日本蟾蜍clu cDNA編碼分泌蛋白。NetNGlyc預測蛋白中Asn-X-Ser/Thr糖基化位點，發現存在6個天冬酰胺糖基化位點，Asp-99、Asp-141、Asp-273、Asp-350、Asp-370和Asp-415（表1）。METAL DETECTOR預測蛋白二硫鍵位點，發現存在可形成二硫鍵的10個半胱氨酸殘基，Cys-98、Cys-109、Cys-112、Cys-117、Cys-125、Cys-281、Cys-291、Cys-298、Cys-301和Cys-309（圖2）。GOR4和COIL預測蛋白二級結構表明，日本蟾蜍CLU在其兩端各形成一個卷曲螺旋（48-97 aa和336-391 aa）（圖3）。

表1 日本蟾蜍CLU中N-糖基化位點預測

圖3 NCOILS 分析日本蟾蜍CLU蛋白的卷曲螺旋

2.2.3 氨基酸序列同源性分析和系統進化樹構建 日本蟾蜍CLU蛋白氨基酸序列在NCBI中同源性分析發現，與非洲爪蟾（Xenopus laevis，NP_001080-775.1）的同源性最高，達到65%，與珠雞（Numida meleagris，AAW21812.1）、斑馬魚（Danio rerio，AAQ56181.1）、安樂蜥（Anolis carolinensis，XP_003229-606.1）、鴨嘴獸（Ornithorhynchus anatin-us，XP_00-1515556.2）、鵪鶉（Coturnix coturnix，CA-A33823.1）、小鼠（Mus musculus，NP_038520.2）、人（Homo sapiens，NP_001822）7種動物的同源性在41%-48%之間。在ClustalX軟件中對蟾蜍與8個物種的CLU蛋白氨基酸序列進行比對（圖4），發現各物種均含有信號肽序列，但其氨基酸組成和數量有所不同；可形成二硫鍵10個半胱氨酸殘基在不同物種之間完全保守；與人CLU序列比對，發現在C端卷曲螺旋中的357位為Val，其他物種為Leu，358 位的Leu物種之間完全保守，除斑馬魚的361位上為Phe外，其他物種都為Leu；預測N-糖基化位點中Asp-99、Asp-141、Asp-350和Asp-370與其他物種完全保守，而Asp-273和Asp-415不存在保守性，表明CLU存在種屬差異。

通過MEGA 4.1軟件鄰接法構建氨基酸序列系統進化樹（圖5），發現日本蟾蜍與同屬兩棲類的非洲爪蟾處于一個分支內，與魚類匯于一個分支。兩種鳥類動物與爬行動物匯于一支。哺乳類最低等的鴨嘴獸與其他哺乳動物匯于一支，但與胎生哺乳動物人和鼠存在一定的差異。整個進化樹表明CLU的進化史遵循傳統動物進化規律。

3 討論

本試驗成功克隆到日本蟾蜍聚集素的全長cDNA，并對該cDNA和其編碼蛋白的氨基酸序列進行了生物信息學分析。SignalP分析該前體蛋白存在信號肽，暗示日本蟾蜍clu cDNA編碼蛋白為分泌蛋白。結構預測顯示日本蟾蜍CLU成熟蛋白是由兩條多肽鏈組成［9，13，14］，含有兩個卷曲螺旋結構域（48-97 aa和336-391 aa），與人CLU相似。在其C端卷曲螺旋中Val-3578、Leu-358和Leu-361有3個疏水性氨基酸殘基，其中后兩個氨基酸不同物種間比較保守，Val-357在人類則是Leu-357。此外，日本蟾蜍CLU成熟蛋白中有10個半胱氨酸殘基可形成5對二硫鍵，存在6個潛在的糖基化位點，這些特征在包括人的其他8種動物的CLU中完全保守［16-18］。

已有研究表明，人類分泌型CLU具有抑制線粒體介導的細胞凋亡、保護細胞的功能［19，20］，但其作用機制還不十分清楚。目前，在RNA水平上抑制分泌型CLU表達，或使用寡核苷酸藥物OGX-011干擾分泌型CLU表達均能增強化學藥物對腫瘤細胞的殺傷力和降低腫瘤細胞的耐藥性，顯示出良好的臨床效果［7］。因此，抑制分泌型CLU對腫瘤細胞的保護可能成為治療腫瘤的新途徑，CLU可能成為腫瘤治療的新靶點。

4 結論

首次克隆到日本蟾蜍clu基因的全長cDNA，該基因編碼的蛋白具有與人類同源蛋白相似的結構特征。日本蟾蜍CLU與其他8個物種CLU的氨基酸序列具有相似性。

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