利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)人胰高血糖素樣肽1的研究

梁宏偉 陳發(fā)菊 王玉兵 李鳳蘭 陸海

（1.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443002； 2. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

II型糖尿病是一種以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和作用缺陷所引起，是影響人類健康的一種主要疾病之一。目前，對(duì)II型糖尿病患者的治療主要從飲食、運(yùn)動(dòng)以及使用藥物等幾個(gè)方面著手，新的治療手段主要是控制機(jī)體代謝、增加胰島β-細(xì)胞數(shù)量和維持其正常生理功能［1］。人胰高血糖素樣肽1（hGLP1）是一種腸肽激素，主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞所分泌，是胰高血糖素原（proglucagon）基因翻譯后加工和修飾的產(chǎn)物，主要通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合后發(fā)揮其生理功能［2］。hGLP1作為一種腸降血糖素，能夠誘導(dǎo)胰島β-細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，減緩胃腸蠕動(dòng)和饑餓感，減少飲食，從而達(dá)到降低血糖的水平［3］。hGLP1能夠明顯降低Ⅱ型糖尿病患者空腹和餐后血糖水平，對(duì)Ⅱ型糖尿病具有較好的療效，同時(shí)對(duì)Ⅰ型糖尿病的治療也具有一定的潛力［4］。

煙草是轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組藥用蛋白、抗體、基因工程疫苗研究的模式植物，其遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟完善。目前利用轉(zhuǎn)基因煙草已成功表達(dá)了葡萄腦苷脂酶（β-glucocerebrosidase）［5］、人生長(zhǎng)激素（hGH）［6］，以及針對(duì)霍亂病毒（cholera）［7］、人類乳突病毒（HPV）［8］、艾滋?。℉IV）［9］和炭疽桿菌（anthrax）［10］等多種治療性蛋白或疫苗。本研究利用煙草這一成熟轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將人胰高血糖素樣肽1（hGLP1）基因?qū)霟煵葜?，并通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步的生物活性檢測(cè)，旨在為轉(zhuǎn)基因煙草作生物反應(yīng)器表達(dá)人胰高血糖素樣肽1提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草（Nicotiana tabacum L.），本實(shí)驗(yàn)室保存。昆明小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，雄性，6-7周齡，體重18-22 g，SPF級(jí)，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-（軍）-2007-004。

各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；所有引物均由上海生工公司合成；Southern blot試劑盒購(gòu)自Roche（Germany）公司；Marker DNA、2×Taq MasterMix、Western blot試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；各種激素、抗生素和組培生化試劑購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

hGLP1基因和PBI121表達(dá)載體由三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心惠贈(zèng)，將含有His-tag標(biāo)簽的hGLP1基因克隆至PBI121質(zhì)粒CaMV35S啟動(dòng)子下游，hGLP1基因兩端限制性酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和SmaⅠ，T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)，圖1。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 植物表達(dá)載體PBI121質(zhì)粒（包含hGLP1基因）T-DNA區(qū)

葉片不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5.2 g/L；繼代、生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5.4 g/L； 遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓力為30 mg/L卡那霉素（Km），除菌羧芐青霉素（Carb）為500 mg/L。以上培養(yǎng)基配制時(shí)均調(diào)pH值6.0。

1.2 方法

1.2.1 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 采用葉盤法［11］進(jìn)行農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化。用含有PBI121-GLP1表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101侵染過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)的煙草小葉塊（0.5 cm×0.5 cm）5 min，然后吸去附著的菌液置于（25±2）℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入附加30 mg/L卡那霉素和500 mg/L羧芐青霉素的不定芽分化培養(yǎng)基上，（25±2）℃，16/8 h光周期下進(jìn)行選擇培養(yǎng)，3周后葉片外植體開(kāi)始分化出抗性不定芽，待不定芽長(zhǎng)到1 cm以上時(shí)，切下并接入附加30 mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.2 GUS組織化學(xué)染色 GUS染色液配方參照J(rèn)efferson等［12］方法稍作修改。50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0）中含有5 mmol/L K4Fe［CN］6，5 mmol/L K3Fe［CN］6，10 mmol/L EDTA-Na2，0.1%（V/V）Triton X-100，20%甲醇，1 mg/L的X-Gluc。X-Gluc需提前溶于DMSO中，再加入上述緩沖液里，混勻后分裝于2.0 mL離心管中置-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)檢測(cè)

1.2.3.1 PCR檢測(cè) 采用CTAB法［13］提取轉(zhuǎn)化植株和野生型煙草植株總DNA。以PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，野生型煙草總DNA為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增檢測(cè)引物：GLP1-F：5'-GGATCCACCATGGGGCATCATCATC-3'；GLP1-R：5'-GCACCAGTCTTCCCTTAACCAGCCAAG-3'。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火35 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。

1.2.3.2 Southern blot檢測(cè) 通過(guò)PCR擴(kuò)增PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA，回收GLP1基因片段，按照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter kit Ⅱ操作手冊(cè)標(biāo)記探針。對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性植株進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)，方法按雜交試劑盒的操作指南進(jìn)行。

1.2.3.3 Western blot檢測(cè) 采用PBS提取緩沖液（NaCl 137 mmoL/L，KCl 2.7 mmoL/L，Na2HPO410 mmoL/L，KH2PO41.76 mmoL/L，pH7.4）提取煙草葉片中總可溶性蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE 電泳，采用半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上。將NC膜置于封閉液中封閉；漂洗，加入稀釋的His-tag標(biāo)簽抗體一抗孵育；漂洗，加入稀釋的羊抗兔-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）二抗孵育；漂洗，使用ECL Western blot Kit進(jìn)行ECL反應(yīng)；X-光片壓片，曝光、顯影、定影。

1.2.4 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白生物活性檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［14，15］將雄性昆明小鼠禁食12-18 h后，檢測(cè)基礎(chǔ)血糖值，挑選血糖值相近的小鼠分成2組，每組8只。分為對(duì)照組和給藥組，對(duì)照組按體重腹腔注射50%葡萄糖溶液同時(shí)給予野生型煙草總可溶性蛋白提取液，給藥組按體重腹腔注射50%葡萄糖溶液同時(shí)給以待測(cè)樣品。

尾靜脈取血測(cè)定血糖值，并記錄血糖值變化的差異。所有數(shù)據(jù)以±s表示，以SPSS12進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異。

2 結(jié)果

2.1 煙草外植體的選擇培養(yǎng)和抗性再生

經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染煙草小葉塊在不定芽分化的選擇培養(yǎng)過(guò)程中，大部分外植體黃化甚至白化逐漸死亡，小部分則仍然正常生長(zhǎng)分化。15-20 d左右，開(kāi)始有部分外植體分化出不定芽。取1 cm以上的抗性不定芽轉(zhuǎn)入附加30 mg/L Km選擇壓的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，最終獲得hGLP1基因轉(zhuǎn)化的煙草再生植株10株。

2.2 煙草抗性再生植株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

分別提取10個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片基因組DNA，采用hGLP1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)以PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化野生型煙草總DNA為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖2）顯示，其中6個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因煙草和陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出了150 bp左右目的條帶，而未轉(zhuǎn)基因野生型煙草則沒(méi)有特異性擴(kuò)增條帶。從而證實(shí)hGLP1基因已經(jīng)成功整合到煙草基因組DNA中。

2.3 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的GUS組織化學(xué)染色

對(duì)轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草再生植株莖葉做GUS表達(dá)檢測(cè)，以未轉(zhuǎn)基因野生型煙草作為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖3）顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草的莖和葉脈中有明顯的藍(lán)斑陽(yáng)性信號(hào)，而野生型煙草則無(wú)GUS藍(lán)斑信號(hào)。從而證明GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中獲得翻譯表達(dá)。由于hGLP1基因和GUS報(bào)告基因串聯(lián)或構(gòu)成融合基因，報(bào)告基因的表達(dá)間接證明hGLP1基因也能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.4 Southern blot檢測(cè)

以含有hGLP1基因的質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，野生型煙草總DNA為陰性對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化植株樣本進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，6個(gè)轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草抗性再生株系均出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性雜交信號(hào)。進(jìn)一步證明hGLP1基因已成功整合到煙草的基因組DNA中，獲得了轉(zhuǎn)人胰高血糖素樣肽1基因的轉(zhuǎn)基因煙草。將Southern雜交檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行擴(kuò)繁，煉苗后移栽至溫室，以便進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和生物活性檢測(cè)。

2.5 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的Western雜交檢測(cè)

由于hGLP1基因序列中融合有6×His-tag標(biāo)簽，在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草是否翻譯表達(dá)hGLP1融合蛋白的Western雜交檢測(cè)中，以Anti-His tag Antibody作為第一抗體，羊抗兔-HRP為二抗，以野生型煙草總可溶性蛋白作為陰性對(duì)照，分別提取6個(gè)株系的轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白進(jìn)行Western雜交檢測(cè)。結(jié)果（圖5）顯示，在2個(gè)株系轉(zhuǎn)基因煙草中可以檢測(cè)到hGLP1融合蛋白的表達(dá)而在非轉(zhuǎn)基因的野生型煙草中沒(méi)有檢測(cè)到特異性雜交條帶。從而證實(shí)了hGLP1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中獲得了翻譯表達(dá)。隨著壓片時(shí)間的延長(zhǎng)，非特異性條帶開(kāi)始出現(xiàn)。

2.6 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白的生物活性

提取轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白，以昆明小鼠葡萄糖性高血糖模型進(jìn)行體內(nèi)生物活性檢測(cè)。葡萄糖對(duì)照組注射50%葡萄糖溶液，同時(shí)給以野生型煙草總可溶性蛋白提取液，給藥組注射50%葡萄糖溶液，同時(shí)給以轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白提取液。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）顯示，對(duì)照組和給藥組腹腔注射18 mmol/kg的50%葡萄糖溶液，10 min后小鼠血糖濃度迅速升高4 7倍，說(shuō)明試驗(yàn)性高血糖模型造模成功。給藥組小鼠腹腔注射18 mmol/kg的50%葡萄糖溶液同時(shí)給以7.5 mg/kg的總可溶性蛋白，在隨后的10、20、40 min時(shí)小鼠血糖濃度均明顯低于葡萄糖對(duì)照組。初步證明轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白具有一定的降血糖生物活性。

3 討論

hGLP1基因由本課題組根據(jù)植物偏愛(ài)密碼子對(duì)堿基序列的優(yōu)化修飾，在基因序列上游添加了在翻譯的起始中有重要作用KOZAK序列［16］，以增強(qiáng)目的基因的翻譯效率，期待能夠在轉(zhuǎn)基因煙草植株內(nèi)高效表達(dá)人胰高血糖素樣肽1。

在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通過(guò)抗生素篩選獲得再生植株仍有相當(dāng)一部分假陽(yáng)性植株，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過(guò)程中葉片常常卷翹變形而沒(méi)有完全接觸到選擇培養(yǎng)基，從而造成部分假陽(yáng)性植株的篩選逃逸。也可能隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，培養(yǎng)基中抗生素逐漸降解導(dǎo)致濃度降低，從而造成假陽(yáng)性植株的再生。因此，在選擇培養(yǎng)的過(guò)程中保證葉片外植體充分接觸選擇培養(yǎng)基，經(jīng)常更換新鮮的培養(yǎng)基，優(yōu)先選取最早分化的抗性芽進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)，可望提高選擇效率。在Western雜交檢測(cè)中，僅有2個(gè)株系能夠檢測(cè)hGLP1融合蛋白的表達(dá)，其余4個(gè)株系沒(méi)有獲得陽(yáng)性信號(hào)。由此可見(jiàn)，不同轉(zhuǎn)化子之間外源蛋白表達(dá)與否及表達(dá)量是存在明顯差異。究其原因可能是發(fā)生基因沉默，或是外源蛋白表達(dá)量太低不足以檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，也可能是表達(dá)的外源蛋白在植物體內(nèi)被降解。外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量低是普遍存的問(wèn)題，有時(shí)甚至發(fā)生基因沉默而不能表達(dá)［17］。Yasud等［18］將GLP1基因?qū)胨局校l(fā)生基因沉默而未獲得胰高血糖素樣肽1的表達(dá)，隨后他們將GLP1與GFP基因構(gòu)建融合序列轉(zhuǎn)化水稻，獲得高效的表達(dá)融合蛋白，但分離純化的過(guò)程中GLP1蛋白丟失，分析認(rèn)為可能是被細(xì)胞內(nèi)水解酶消化。

表1 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白的生物活性（血糖濃度單位：mmol/L）

以模式植物煙草作為生物反應(yīng)器的受體，比較高效的遺傳轉(zhuǎn)化效率是其最大優(yōu)點(diǎn)。但是也存在著一定的問(wèn)題，主要表現(xiàn)為煙草中含有大量的尼古丁等生物堿毒素，毒性較大，4 0 60 mg劑量即可使人致死［19］。以煙草作為生物反應(yīng)器表達(dá)的藥用蛋白無(wú)法直接使用，需精細(xì)純化后才能應(yīng)用。本研究中提取煙草總可溶性蛋白測(cè)試小鼠體內(nèi)生物活性發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是對(duì)照組還是給藥組小鼠注射煙草總可溶性蛋白提取液后不斷顫抖，可能是煙草中生物堿毒素所致，下一步將采用分離純化的hGLP1融合蛋白進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)生物活性檢測(cè)。分離純化轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的重組藥用蛋白，無(wú)疑會(huì)大大提高重組藥用蛋白的生產(chǎn)成本，不符合植物生物反應(yīng)器廉價(jià)地生產(chǎn)重組藥用蛋白的主旨。盡管目前已經(jīng)有多種植物被用作生物反應(yīng)器的受體來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白、重組疫苗，如煙草、 谷類作物、 豆類、 蔬菜與根莖類作物等，但是還沒(méi)有找到公認(rèn)的最好的適于商業(yè)生產(chǎn)的植物物種和組織［20］。

4 結(jié)論

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化，hGLP1基因已成功地整合到煙草基因組中并獲得轉(zhuǎn)化再生植株，hGLP1融合蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中獲得表達(dá)，初步的動(dòng)物試驗(yàn)表明該融合蛋白具有一定的降血糖生物活性。

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